[发明专利]一种诱导红豆杉种子种胚获得愈伤组织和悬浮细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养和细胞工程领域，具体涉及一种诱导红豆杉种子种胚获得愈伤组织和悬浮细胞的方法。

背景技术

紫杉醇（Paclitaxel，商品名Taxol）是20世纪六七十年代从红豆杉科（Taxaceae）红豆杉属（Taxus L.）植物树皮中分离出来的一种天然的四环二萜类生物碱，因其在肿瘤治疗中的独特效果而广受人们关注。据相关资料介绍，估计国内外在21世纪初期对紫杉醇针剂的需求量约2000万支，即需用紫杉醇600kg，目前市场售价为1200-1800元/支不等。随着对紫杉醇需求量的日益递增，目前仅仅从红豆杉的树体中提取的产量已经不能满足医药市场需要，加之大肆的开采使红豆杉自然资源日趋枯竭、红豆杉资源自然更新能力差、生长缓慢、濒危灭绝，各国政府已明文规定禁止砍伐野生红豆杉资源。

因此紫杉醇其他途径的开发就显得极为重要，其中利用红豆杉细胞进行离体培养就是一条重要的途径，一方面可以加强对红豆杉野生种质资源及其生态环境的保护，另一方面可以满足供需间的差距，并且细胞培养繁殖率高，培养条件易于优化和控制，产物较易分离，从长远来看是解决紫杉醇供需矛盾的最佳途径。

国内外关于红豆杉细胞、组织培养和紫杉醇鉴定、分离和纯化方面的研究工作已经开发了较为完善的实验室技术体系，并且具有相当规模的工厂化生产系统。在其大规模培养生产紫杉醇的核心是要筛选得到具有高产、优质、遗传稳定的细胞种质资源，这是利用红豆杉细胞进行大规模生产紫杉醇的前提。在以红豆杉茎段或者其他成年态的材料为外植体建立细胞系的过程中污染率较高，比较的浪费人力、财力和物力（鲁明波，红豆杉高产细胞株的筛选及培养条件优化，2000，华中科技大学博士论文）。红豆杉种胚可以直接或者间接诱导成愈伤组织细胞无性系，并具有产生紫杉醇代谢的能力。中国红豆杉刚刚萌动的种胚可以在培养基上离体培养得到愈伤组织细胞系，并通过筛选得到细胞生长快、紫杉醇含量高的细胞系（张长河等，红豆杉胚源细胞株的培养和紫杉醇的生产，华中理工大学学报，2000,28（1）：82-85）。Sung HS等利用日本红豆杉的成熟种胚在B5培养基上诱导出了愈伤组织，并进一步进行了紫杉醇的检测（Sung Ho Son,et al,selection and proliferation of rapid growth cell lines from embryoderived cell cultures of Yew Tree(Taxus cuspidate Sieb.Et Zucc),Bioprocess Eng,1994,4,112-118）；Wann RS等短叶红豆杉、欧洲红豆杉和日本红豆杉的胚乳为材料在BLCG培养基上成功诱导得到体细胞胚胎，并成功增值用于紫杉醇的提取（Wann et al.,induction of somatic embryogenisis in taxus,and the production of taxane-ring containing alkaloids therefrom,United States Patent,US005310672A）；Mihaljevi等[19]利用欧洲红豆杉的成熟种胚为材料，在B5培养基上直接成功诱导出愈伤组织、增殖，并用高效液相色谱检测到紫杉醇的产生（Mihaljevic S et al,effect of explant source and growth regulators on in vitro callus growth of Taxus baccta L.Washingtonii,Food Technol.Biotechnol.2002,40(4):299–303）。

以上4篇文献有关于中国红豆杉、短叶红豆杉、欧洲红豆杉和日本红豆杉种胚间接或直接诱导愈伤组织组织或者体细胞胚胎发生的报道，但没有直接诱导成疏松并直接适合细胞悬浮培养的文献报道或者专利公开。

发明内容

本发明的目的在于提供一套利用南方红豆杉种胚直接诱导成疏松的愈伤组织的方法，并提供利用该愈伤组织进行悬浮培养获得悬浮细胞的方法，克服了茎段诱导愈伤组织高污染率、低效率或方法存在的缺陷，以便快速、高效、大规模地获得分散性能好的悬浮细胞，为红豆杉的细胞悬浮培养提供原料或者进一步筛选高产紫杉醇细胞株提供优质筛选材料。

本发明的目的是通过以下方式实现的。

一种诱导红豆杉种子种胚获得愈伤组织的方法，包括以下步骤：