[发明专利]一种食品中2-萘胺的酶联免疫吸附检测方法

说明书

技术领域

一种检测食品中偶氮染料的酶联免疫吸附检测方法，属于免疫学检测分析领域。

背景技术

偶氮是染料中形成基础颜色的物质，且偶氮染料合成方法较为简单、结构多变，因而种类繁多，很多染料都属于此。偶氮染料因其易于发生偶氮还原裂解而可以产生20余种致癌芳香胺而备受关注，并成为食品、皮革、玩具等产品中化学品成分分析的一项极其重要的内容，而联苯胺和2-萘胺是其中致癌性最强的两种芳香胺，它们是合成许多工业染料及食品色素的中间物。然而随着食品工业的不断发展，人们对于食品感官品质的要求也不断提高，偶氮染料凭借其自身颜色鲜艳、着色简单、稳定等其它染料不可比拟的优越性，而被谋取暴利的不法商贩越来越多地添加到食品中，如苏丹红。对于偶氮染料的检测，主要是通过检测其产生的芳香胺来实现对其监控的。目前，芳香胺的检测主要依靠传统的气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用等仪器分析检测，这些检测方法虽灵敏、准确，但均依赖昂贵而庞大的仪器设备，因此检测成本较高，而且耗时、前处理复杂繁琐，很难满足现场检测的快速简便而灵敏高效的要求。故而，研究出一种快速、灵敏、简便、准确、高效而价廉的免疫学检测方法，势在必行。然而酶联免疫学迄今在此领域鲜有涉足，因而，开展此项研究的必要性和重要性可见一斑。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明旨在建立一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单、快速、价廉等特点的酶联免疫吸附检测方法，用于含偶氮染料的食品的批量、快速检测分析。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明建立了2-萘胺的酶联免疫吸附检测方法，并对检测方法进行了条件优化。

其中，样品前处理：根据国标GB/T 17592-2006：将食品样品剪成5mm×5mm的碎片，均匀混合后准确称取3.00g样品置于具塞锥形瓶中，加入50mL pH 6.0的柠檬酸盐缓冲溶液，70℃水浴搅拌反应30min，然后加入10mL连二亚硫酸钠溶液，继续上述水浴搅拌反应30min，待反应结束后，将试管迅速用流动自来水冷却至室温，如此即可将食品中的偶氮染料还原为相应的芳香胺，然后滤去残渣，备用。

其中，包被2-萘胺抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被原是半抗原2-萘胺与卵清蛋白(OVA)的偶联复合物，所用包被缓冲液是0.05 M pH9.6碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含2％明胶的上述包被缓冲液。

其中，2-萘胺多克隆抗体是用2-萘胺与牛血清白蛋白(BSA)的重氮化法偶联复合物，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，并以一定的免疫剂量多次加强免疫健康的新西兰大白兔制备得到的。

其中，酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体（GAR-HRP）。

其中主要溶液的配制：

0.01M磷酸盐(PBS)缓冲液：氯化钠8 g、磷酸二氢钾0.24 g、磷酸氢二钠3.62 g、氯化钾0.2g，用超纯水定容至1L。

洗涤液(PBST)：为含有0.05%吐温-20的0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲液。

抗体稀释液：含0.1%明胶的PBST溶液。

标准品稀释液为甲醇溶液。 

0.05M pH 9.6的碳酸盐（CBS）缓冲溶液：称取1.59g Na₂CO₃、2.93g NaHCO₃，加超纯水稀释至1L。

显色液：由A液和B液两种溶液构成，A液配方为：9.33 g柠檬酸，36.8 g Na₂HPO₄·12H₂O，180 μL 30%的H₂O₂，用超纯水定容至1L；B液配方为600 mg四甲基联苯胺溶于1L乙二醇，并超声振荡几分钟。二者均贮于4℃冰箱中保存，使用时将A液和B液以A︰B=5︰1的体积比混匀即可。

终止液：为2mol/L的H₂SO₄。

本发明方法的检测分析原理是：