[发明专利]一种食品中2-萘胺的酶联免疫吸附检测方法

权利要求书

1.一种食品中偶氮染料的还原物2-萘胺的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于：

（1）抗原的包被

将2-萘胺与卵清蛋白OVA重氮化法偶联，并以此偶联复合物作为包被抗原，以0.05 M、pH 9.6的碳酸钠缓冲液稀释包被抗原，抗原稀释倍数分别为2000、4000、8000、16000倍，向酶标板的每孔中加入上述不同稀释倍数的包被液100μL，4℃孵育过夜，用添加有2％明胶的上述包被缓冲液作为封闭液封闭；

（2）竞争反应

将免疫制备的2-萘胺多克隆抗体用抗体稀释液分别稀释1000、3000、9000倍后，加入酶标板中，每孔加50μL，同时分别加入浓度为0 ng/mL，2 ng/mL，5 ng/mL，10 ng/mL，20 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL的2-萘胺标准品，每孔加入50μL，37℃孵育1h，然后用PBST洗涤液置于摇床上洗涤3次，每次3min；

所述洗涤液PBST：为含有0.05%吐温-20的0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲液；

抗体稀释液：含0.1%明胶的PBST溶液；

（3）加酶标二抗

加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体GAR-HRP，用抗体稀释液进行5000倍稀释，每孔加入100μL，37℃温育1h，以PBST置于摇床上洗涤3次，每次3min；

（4）显色

向酶标板的各孔中分别加入100 μL显色液，于37℃恒温箱中反应15 min，取出酶标板，向每孔加入100 μL终止液2 mol/L的硫酸，用酶标仪测定450nnm处的吸光值A₄₅₀。

2.根据权利要求1所述的2-萘胺酶联免疫吸附检测方法，其特征在于，PBST洗涤液的配方为1000 mL蒸馏水中加入氯化钠8 g、磷酸二氢钾0.24 g、磷酸氢二钠3.62 g、氯化钾0.2g、和吐温-20 0.5 mL。

3.根据权利要求1所述的2-萘胺酶联免疫吸附检测方法，其特征在于，显色液由A液和B液两种溶液构成，A液配方为9.33 g柠檬酸，36.8 g Na₂HPO₄·12H₂O，180 μL 30%的H₂O₂，用超纯水定容至1L；B液配方为600 mg四甲基联苯胺溶于1L乙二醇，并超声振荡几分钟，然后分装使用；二者均贮于4℃冰箱中保存，使用时将A液和B液以A︰B=5︰1的体积比混匀。