[发明专利]结核杆菌重要抗原的高通量筛选及其在结核病诊断中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及结核杆菌重要抗原的高通量筛选及其在结核病诊断中的应用。

背景技术

结核病(Tuberculosis,TB)是世界上单一致病菌引起死亡最多的疾病。据WHO估计，全球约有20亿人感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)，每年有约200万人死于结核病。中国是22个结核病高负担国家之一，占全球结核病病例的80%。目前全国有1/3以上的人口感染了结核分枝杆菌，其中活动性结核患者450万，每年约25万人死于结核病，居各类传染病之首。

近年来，随着耐药结核病的流行和TB-HIV共感染，全球结核疫情进一步加重。尽管世界卫生组织倡导直接观察下的治疗（the directly observed therapy,DOTS），大大缩短了治疗周期，但目前仍然无法快速确诊病例进行早期干预和治疗，成为结核病疫情预防和控制的绊脚石。

结核分枝杆菌不同于其他细菌，其生长极为缓慢，且为胞内寄生，因此易形成潜伏感染和耐药菌株，致病性主要与细菌感染和细胞免疫造成的免疫病理损伤有关。目前实验室诊断归纳为三类：病原学诊断、核酸诊断和免疫学诊断。

病原学诊断以痰涂片镜检和细菌培养为基石，是临床常规诊断方法。其中痰涂片镜检敏感性约为35～80%，合并感染HIV阳性病例敏感性降至20%，对儿童TB和肺外TB的检出率更低。细菌培养作为诊断的“金标准”，需要生物安全设施，且耗时长，一般需2～8周完成，在一般医院难以开展。

近年来，应用分子生物学和免疫学方法研发新型诊断技术已成为研究的热点。分子生物学是以核酸扩增为原理，检测MTB特异性核酸，虽然特异性有所提高，但敏感性差异较大，易出现“假阳性”。2010年底，WHO推荐Xpert MTB/RIF（Cepheid）技术作为一种全新快速核酸扩增检测MTB方法,其优点是检测痰标本，操作简单，检测时间缩短至2小时，但难以区分活性TB和潜伏TB。检测仪器昂贵，检测费用动则上千元，限制了其在发展中国家应用。

免疫学诊断方法是检测外周血特异性抗原或抗体，或者外周血特异性T细胞。特异性T细胞检测主要为传统的结核菌素实验，此方法因难以区分卡介苗免疫和TB现症感染，其应用目前局限于5岁以下儿童免疫接种效果的监测。近年开发的γ-干扰素的释放（interferon gamma release test，IGRAs），包括试剂盒QuantiFERON-TB Gold In-Tube test(QFT-GIT)(Cellestis)以及T-SPOT.TB test(T-Spot)(Oxford)，是检测患者对MTB的特异性细胞免疫反应，即用MTB特异抗原ESAT-6、CFP-10和TB7.7刺激患者外周血T细胞后检测γ-干扰素的释放。QFT-GIT和T-Spot的检测敏感性约为76%和60%，特异性约为61%和52%，能够区分卡介苗免疫和TB现症感染，但难以区别潜伏感染和活动性TB。对儿童TB的检测显示，IGRAs并不适用于5岁以下儿童的TB诊断。目前这类试剂盒价格十分昂贵，在我国其应用受限于科研，难以在临床推广应用。

检测外周血特异性抗原或抗体方法多是基于传统的酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）。相比较而言，ELISA技术简便快速，可操作性强，因此广泛应用于临床免疫学检验。应用ELISA等免疫诊断技术达到理想敏感性和特异性的关键是筛选到特异性的理想抗原或抗体。由于MTB抗原远较病毒复杂，其又与牛结核分枝杆菌（卡介苗）和非结核分枝杆菌抗原谱接近，而卡介苗人群免疫率高，因此筛选MTB特异的、有效区分活动性TB和潜伏TB的理想抗原是研发的关键。近年来利用比较基因组学和蛋白质组学研究，筛选到了一些MTB特有的而BCG、其他非结核分枝杆菌缺失的抗原，例如RD1到RD16区的分泌抗原ESAT-6、CFP-10等。采用单一、重组或融合抗原检测血清抗体的敏感性为1%～60%，特异性为53%～99%，未能区分活性和潜伏感染。这与MTB引起慢性感染，TB患者细菌载荷与疾病的进程影响TB患者抗体谱多样性密切相关。

如何在结核高负荷的国家和地区，采用简便、快速、灵敏，仅需简单技术和设备的现场诊断方法(point of care,POC)，是世界卫生组织、结核组织联盟和比尔盖茨基金会等以及我国政府“十二五”规划致力解决的重大技术问题。

发明内容