[发明专利]一株产α-酮戊二酸的菌株及用其发酵生产α-酮戊二酸的方法

说明书

技术领域

本发明采用微生物发酵法生产α-酮戊二酸。发明内容涉及一株基因改造后丙酮酸代谢过程可动态调控的α-酮戊二酸高产菌株，以及相关的发酵生产技术。本发明是一种高光学纯度和化学纯度的α-酮戊二酸制造技术，发酵生产过程中只有痕量琥珀酸，乙酸等杂酸的生成。属于微生物发酵工程技术领域。

背景技术

α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，α-KG)，又名α-氧代戊二酸，α-胶酮酸，α-羰基戊二酸，α-酮基戊二酸，在细胞代谢中起重要作用，是三羧酸循环的重要中间产物之一，在生物体内参与氨基酸、蛋白质和维生素的合成以及能量代谢。α-酮戊二酸在医药工业、饲料工业、有机合成和功能性食品等领域应用广泛。医药工业方面，α-酮戊二酸主要作为生化试剂和测肝功能的配套试剂，另外α-酮戊二酸还具有抗氰作用，可以起到抗惊厥作用；饲料工业方面，作为饲料添加剂可以提高动物抗应激能力，增强免疫功能，促进骨骼发育和提高繁殖率；有机合成方面，α-酮戊二酸也是重要的化工合成中间体，用于多种衍生化学品的合成；功能性食品方面，α-酮戊二酸主要作为运动营养饮料的成分，同时可以降低术后患者和长期病人的机体损耗。

目前α-酮戊二酸的合成主要采用化学合成法。与化学合成法相比较，微生物发酵法用于α-酮戊二酸的合成在产品制备过程和产品品质方面均优势明显。因此随着优良生产菌种的选育和发酵技术的不断成熟，微生物发酵法必将会取代化学合成法成为α-酮戊二酸的主要合成方式。多种微生物被报道可以用于α-酮戊二酸的发酵生产，包括解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)以及谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)等细菌。而大肠杆菌用于α-酮戊二酸的发酵生产未见报道。

大肠杆菌作为遗传背景最为清晰的微生物之一，被广泛的用于包括人类在内的生命体代谢相关机理的研究。随着大肠杆菌代谢网络和分子水平上调控机理的不断被揭示和阐明，单一代谢中间体在大肠杆菌中的积累研究成果丰硕。目前，乙醇，乙酸，丙酮酸，琥珀酸，苹果酸，乳酸等多个代谢中间物的大量合成均可以在大肠杆菌中实现。一分子葡萄糖通过EMP途径形成两分子丙酮酸的过程中会形成两分子NADH，两分子丙酮酸形成乙酰辅酶A的过程则会再产生两分子NADH。乙酰辅酶A进入TCA循环后会形成更多NADH用于产生能量合理高能化合物ATP等。

大肠杆菌中，丙酮酸主要有四个流向。一是磷酸烯醇式丙酮酸合酶（pps）作用下回流形成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）。二是经丙酮酸氧化酶（pox）作用下直接形成乙酸。三是经乳酸脱氢酶（ldhA）作用还原形成乳酸。四是形成乙酰-CoA。丙酮酸形成乙酰-CoA存在两条途径，一条途径是，丙酮酸在甲酸裂解酶（pfl）的作用下形成甲酸和乙酰-CoA，该途径主要在氧气不足时发挥作用。另一条途径是，氧气存在条件下，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶复合体（pdh）的作用下脱羧氧化形成乙酰-CoA。因此，失活磷酸烯醇式丙酮酸合酶（pps）、丙酮酸氧化酶（pox）、甲酸裂解酶（pfl）和乳酸脱氢酶（ldhA）后，丙酮酸主要在丙酮酸脱氢酶复合体（pdh）作用下流向乙酰-CoA，进而进入TCA循环。在此基础上阻断α-酮戊二酸的分解代谢途径，获得的菌株即为α-酮戊二酸发酵生产菌株。由于α-酮戊二酸的下行代谢途径主要由α-酮戊二酸脱氢酶复合体催化完成。因此可以通过失活脱氢酶复合体实现上述设想。然而α-酮戊二酸脱氢酶复合体和丙酮酸脱氢酶复合体同属于α-酮酸脱氢酶复合体，其催化单元属于同一个催化酶系。因此，α-酮酸脱氢酶复合体主要酶系（如E1，E2和E3）的辅因子同时参与α-酮戊二酸脱氢酶复合体和丙酮酸脱氢酶复合体。有益的是，这些辅因子会优先作用于丙酮酸的脱氢酶复合体形成乙酰-CoA，因此控制细胞中该酶系辅因子的水平可以有效的实现丙酮酸形成乙酰-CoA途径顺畅的同时使得α-酮戊二酸下行分解代谢受阻，进而实现α-酮戊二酸的过量积累。本发明正是基于这一策略成功构建了高效合成α-酮戊二酸的重组大肠杆菌，并建立了对应的简洁发酵工艺。