[发明专利]细鳞鱼Cathelicidin抗微生物肽CATH_BRALE及其基因、制备、应用

说明书

技术领域

本发明提供一种来源于细鳞鱼（Brachymystax lenok）的cathelicidin家族广谱抗微生物肽CATH_BRALE及其基因, 制备方法和在医疗、生物制药及水产养殖病害防治中的应用，属于生物医学技术领域。 

背景技术

Cathelicidin是一类由N端信号肽区域、中间保守cathelin 结构域和C端高度特异的成熟肽区域构成的具有多功能的抗菌肽家族,在几乎所有种类的动物体内(哺乳类、鸟类、两栖类和鱼类)都有发现。与防御素(defensin)一样，Cathelicidin是包括人类在内的大多数脊椎动物所特有的宿主防御肽，构成了脊椎动物自然免疫反应的关键组分，是连接自然免疫和特异性免疫的桥梁。Cathelicidin具有广谱的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌以及病毒具有非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药细菌同样具有作用。除此之外，Cathelicidin还具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞（中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞和T细胞）具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。Cathelicidin基因的缺失或异常表达都将导致人类严重疾病的发生。最新研究发现，系统性红斑狼疮和牛皮癣的发病与人体内Cathelicidin LL-37的过度表达有关。由于具有如此众多的活性，Cathelicidin一直是国际上研究的热点。针对Cathelicidin的药用开发则蕴含着巨大的临床治疗药物制备价值。 

由于近年来抗生素的滥用，导致致病性微生物耐药性的问题日益严重，在临床上已经出现了大量能够完全耐受青霉素等传统抗生素的微生物。最近，一种携带编写NDM-1酶基因的“超级病菌”的出现，罪魁祸首正是抗生素的滥用和误用。这种酶可分解β-内酰胺环结构，因此可使目前为止临床最常用的抗生素， 包括青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素失效。而Cathelicidin家族抗微生物肽的杀菌机制是通过破坏细菌细胞膜的完整性介导的：通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致细菌细胞的死亡。除此之外，越来越多的文献报道表明抗菌肽还具有其他的杀菌机制，如抑制细菌细胞壁合成、改变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的合成等。正是由于作用方式的不同，Cathelicidin介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不会产生耐药性。体外抗微生物测试中，大多数Cathelicidin成熟肽可以在微摩尔和亚微摩尔的浓度下快速杀死广泛的微生物。Cathelicidin成 熟肽表现抗微生物肽的典型特征：大多数Cathelicidin成熟肽分子量小于5000，中性pH条件下带净正电荷，缘于它们含有多个碱性氨基酸残基；富含疏水碱基，整体具有两亲性的拓扑结构。 

目前Cathelicidin抗菌肽药物研究热点主要集中在消炎、抗感染和抗真菌等方面，应用方式可以是局部的也可以是系统的，剂型可以是口服也可以外用。尤其由于阳离子抗菌肽的表达与皮炎、侵入性烧伤脓血症、肿瘤病毒引起的肉赘等之间的病理联系，这些抗菌肽对这些疾病的局部治疗有较好的开发前景。例如中科院昆明所优选出蛇cathelicidin抗菌肽对500多株临床耐药菌株显示了较强的抗菌活性，同时具有极低的哺乳动物细胞毒性以及溶血活性，优于美国正进行III期临床的同类候选药物pexiganan；来源于猪protegrin的IB-367用于治疗肿瘤患者口腔溃疡，已进入临床III期试验。LL-37作为治疗囊肿性纤维化支气管炎的局部杀菌剂、及人抗菌肽CAP-18及其衍生物用于治疗上呼吸道感染、呼吸道感染、鼻窦炎、中耳炎等疾病的药物均已经成为生物制药领域内的研究热点。不仅限于医药领域，在农业、畜牧业和日化用品领域，cathelicidin也存在巨大的应用潜能。