[发明专利]含有荧光素酶基因的四膜虫细胞株及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程细胞株，具体是一种含有荧光素酶基因LUC的四膜虫细胞株及其构建方法和应用，更具体地说是一种含有四膜虫偏爱密码子的LUC的四膜虫细胞株以及该细胞株对水体环境中重金属污染的监测。

背景技术

环境污染问题是目前全球最严重的问题之一，目前在实际应用中最常用的监测手段是利用仪器对环境中重金属进行理化监测，但监测过程需要明确污染物成分，而且监测结果不能反映一些关键参数如生物利用度、毒性及遗传毒性等，使得检测目标局限性和检测结果片面性，随着研究人员对模式生物的深入研究，提出了全细胞生物传感器（WCB）的概念，即用整个原核或真核细胞作为一个报告体，包括生物受体和生物转换器两种元件。纤毛类原生动物四膜虫传承了细菌和酵母等生物用于全细胞生物传感器的优点外，由于它在营养期没有细胞壁，且通过胞吞和吞噬作用可以更敏感的接触水环境中的应激物，从而可以产生快速应答；另外由于与细菌和酵母等相比在基因水平上，四膜虫与人类基因的同源性更高，因此可以在环境毒性试验中作为模式生物替代动物试验。

四膜虫金属硫蛋白（MTT1）启动子能够被多种重金属离子诱导表达，因此能够作为潜在的环境污染物应答元件。通过基因重组将GFP基因原位取代部分MTT1基因，在生长环境中含有重金属等应激因素时，细胞能够发出绿色荧光。但不能够定量检测环境中的污染指数。通过重组将萤火虫荧光素酶基因原位取代BTU2基因，在生长环境中含有重金属等应激因素时，细胞能够定量检测环境中的污染指数，但是由于细胞内的金属硫蛋白对重金属的螯合作用，使得工程细胞的敏感性降低。

如何使检测更快速、更敏感是四膜虫细胞株用于环境中重金属的生物监测所面临的关键环节。通过将荧光素酶基因取代MTT1基因，一方面削弱了MTT1原本的解毒反应，使得重组细胞株更加敏感。另一方面，荧光素酶与底物显色反应可以通过荧光仪定量检测环境中的重金属污染。

目前，国内外已经有将细菌、酵母以及四膜虫构建的全细胞生物传感器用于水环境生物监测中的报道，但本发明构建的含有荧光素酶的四膜虫细胞株还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有荧光素酶基因的可诱导表达的四膜虫细胞株；并提供一种构建该四膜虫细胞株的方法；以及该细胞株在检测水体环境中重金属污染方面的应用。

本发明提供的一种荧光素酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明提供的一种含有荧光素酶基因的四膜虫细胞株，分类命名：嗜热四膜虫，拉丁文学名：Tetrahymena thermophila,已于2012年5月17日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.6139。

本发明含有荧光素酶基因的四膜虫细胞株的构建方法，包括如下步骤：

（1）利用四膜虫偏爱密码子表将核苷酸序列为SEQ ID NO：1的萤火虫荧光素酶基因的N-端和C-端序列优化为能在四膜虫中高效稳定表达的密码子，并在序列的N-端加上BamH I酶切位点，在C-端加上Asc I酶切位点，合成特异性引物：

上游：5’-ggatcc agt gaa gac gcc aaa aac atc aag aaa ggc ccc gct cct ttc tat ccg c-3’（SEQ ID NO：3）

下游：5’-ggcgcgcc tca gac ggc gct ctt acc acc ctt ctt ggc ctt gat gag gat-3’（SEQ ID NO：4）

经PCR扩增获得优化的萤火虫荧光素酶基因LUC，将LUC基因连接到过表达载体pBX中，获得重组质粒pBX-LUC；

（2）将重组质粒pBX-LUC纯化、浓缩并由Xho I酶切线性化后，应用基因枪粒子轰击法转入饥饿18-24h的对数生长期的嗜热四膜虫B2086中进行基因重组，通过增加巴龙霉素浓度筛选含有萤火虫荧光素酶基因的重组嗜热四膜虫细胞株；

（3）在细胞株可生长的最大浓度巴龙霉素条件下，吸取单细胞培养到对数生长期，获得大量细胞株B2086-LUC，并将其冻存在液氮中。

该细胞株在生长的环境中存在重金属污染时，诱导MTT1基因的启动子启动萤火虫荧光素酶的表达，荧光素酶能够和底物反应，快速显色，检测过程简单快速。