[发明专利]整合质粒pOPHI及无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种整合质粒pOPHI，以及一种无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌。 

背景技术

分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类细长略弯曲的微生物，有时有分枝或出现丝状体。目前在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌中。对人致病的放线菌可分含和不含分枝菌酸两类。分枝杆菌属于含分枝菌酸类。 

本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸。这和其染色性、生长特性、致病性、抵抗力等密切相关。一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌(acid-fast bacilli)。该菌属无鞭毛、无芽胞、一般不产生内、外毒素，其致病性和菌体成分有关。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽肿。分枝杆菌种类较多，主要可分为结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌三类。 

结核分枝杆菌可发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。卡介苗（BCG）就是Calmette和Guerin 2人(1908)将牛结核分枝杆菌在含甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒活疫苗株，现广泛用于预防接种。 

根据菌落色素与生长速度可将非结核分枝杆菌分为4组。第Ⅳ组：迅速生长菌。在25～45℃生长。生长快，培养5～7 d即可见到菌落，菌落粗糙，有的并能产色。耻垢分枝杆菌(M．smegmatis)即是其中一种。 

结核分枝杆菌（Mtb）是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病，全世界现在每年因结核病死亡约200万人。 

结核分枝杆菌生长缓慢，难于对其进行遗传操作，需要昂贵的带负压的3级生物安全实验室，长时间培养不仅占用空间而且容易污染等等使结核分枝杆菌的研究耗时耗财耗力。 

以抗Mtb药物的研发为例，抗Mtb药物的研发昂贵且周期长。近半个世纪以来尚无一种新作用机制的药物用于临床治疗。研究抗Mtb药物最核心的难题之一就是缺乏有效，快速和廉价的模型，特别是体内模型。 

目前最常见的抗Mtb药物体外筛选是利用表达荧光素酶^[1]或绿色荧光蛋白（GFP: Green fluorescent protein）^[2]的重组菌或利用染料阿尔玛蓝(alamar blue)可以区分活菌与死菌的特性^[3]进行筛选。 

其中，表达细菌荧光素酶操纵子的重组菌因为不需要加入底物或进行诱导，自身即可实现发光，故称之为自主发光菌。 

之前构建的自主发光的Mtb并发现利用该菌可简单，快速，经济地进行大规模抗Mtb药物体外筛选和连续检测药物/疫苗在活体小鼠的效果。该发明可极大减少体外对药物筛选、评价及对药物和疫苗体内效果评价中所需的时间，精力，动物，花费等，特别是对抗Mtb药物的研发可能具有变革意义。 

现有技术构建的自主发光的Mtb是通过电转化人工构建的质粒，然后将自主发光元件框整合到Mtb基因组中从而使之发光。现有技术方案的实现方式：现有技术方案主要是利用整合质粒pTYOK^[4]。该质粒含有荧光素酶操纵子基因luxCDABE、卡那霉素抗性基因、整合酶基因Int。LuxCDABE : 荧光素酶操纵子，该系列基因的表达使得宿主菌可以自主发光。整合酶基因Int，可以表达出整合酶，将质粒整合进分枝杆菌的基因组中。将此质粒电转化入Mtb菌中，使用卡那抗性筛选出阳性克隆，并检测到发光，即获得目标菌株。但该菌株由于含有卡那霉素抗性基因，在药物筛选/评价中，可能存在交叉抗性。由于对分枝杆菌进行遗传操作，仅有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因比较有效。因此，利用可自主发光分枝杆菌进行研究时，如果所用菌株具有抗性基因，这会对以后的遗传操作带来不便。例如，基因敲除/遗传互补一般至少需2种抗性基因；重组工程技术也需要至少2种抗性基因等。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种整合质粒pOPHI。 

本发明的另一个目的是提供一种无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌。 

本发明所采用的技术方案是： 

整合质粒pOPHI，其包括：启动子，发光所需酶基因（LuxCDABE），整合酶基因（Int）和抗性筛选基因的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DifL，以及噬菌体整合位点(attP)和复制子。