[发明专利]一种重组人表皮生长因子的新型制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种Ssp内含肽系统介导的重组人表皮细胞生长因子的新型制备方法。

背景技术

人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)是由53个氨基酸组成的的小分子多肽，分子量6.2KD左右，等电点4.2-4.6，对热稳定，耐胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶的消化。该分子中含有六个半胱氨酸，在半胱氨酸6-20、14-31、33-42之间形成三个二硫键，从而分别形成三个环，这些环状结构使得hEGF对蛋白酶具有较高的稳定性。

人表皮生长因子是一种强有力的细胞分裂促进因子，它能够刺激表皮、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞和毛细血管生长，因此用于可用于治疗皮肤烧伤、外科伤口的愈合，以及外伤性角膜溃疡、角膜损伤、化学试剂灼伤角膜以及角膜移植；hEGF能够抑制胃酸分泌，增加细胞内DNA、RNA和蛋白质合成量，促进胃肠上皮细胞生长，从而促进胃溃疡、十二指肠溃疡愈合。

hEGF在化妆品中具有促进皮肤组织细胞增殖与生长，使新生年轻细胞迅速代替衰老或死亡细胞，从而降低构成细胞的平均年龄，达到美白、抗衰老和增加皮肤弹性和光泽的作用，因此作为化妆品原料添加于化妆品中对肌肤有修复、调养、祛痘等功能。hEGF作为添加剂还可以添加到牙齿护理剂、牙膏、洗发水以及饲料添加剂中。

目前hEGF生产有三种方法，①化学合成：1988年Marchi等人首先完成了EGF的全合成，由于hEGF分子中二硫键及其他多种官能团的存在，因而合成的产物纯度及产率都无法满足工业化生产要求；②生物来源提取：主要从人尿液中分离回收，天然来源中hEGF浓度低，一般小于1ug/L左右，因而分离提纯效率低；③基因工程技术：hEGF的生产目前重点在基因工程技术的研究。

利用基因工程方法独立表达hEGF非常困难，因为hEGF是小分子多肽，分子量仅为6.2KD左右，且含有3对二硫键，在细菌胞质中很难单独形成包涵体，表达产物在胞内的堆积会造成蛋白酶的攻击而发生降解。目前多采用分泌表达载体或融合表达载体实现hEGF在细胞中的高水平表达。分泌表达载体表达的发酵液中hEGF初始浓度较高，但是发酵后获得的发酵液体系大，纯化工艺复杂，通常需要3-6步层析操作才能够获得纯度较高的rhEGF，收率仅为20％左右；胞内融合表达rhEGF是在目的蛋白之前或之后加入特定的亲和标签，如His、Gst等，形成融合蛋白，这些亲和标签能够通过亲和层析获得纯化的融合蛋白。由于融合蛋白中含有亲和标签，所以需要蛋白酶将亲和标签从融合蛋白中移除下来，从而获得纯化的目的蛋白。但是所需要的蛋白酶不仅价格昂贵，而且带来了另外的问题：①需要将目的蛋白从亲和标签、融合蛋白以及蛋白酶中分离出来，增加了纯化的步骤，降低了目的蛋白的收率；②目的蛋白上可能存在蛋白酶的敏感位点，造成错误切割，降低得率。

采用自切割内含肽介导的蛋白表达纯化方法可以克服以上缺陷。已有商品化的自切割亲和纯化系统主要有New England Biolabs(NEB)公司的IMPACT、IMPACT-CN及IMPACT-TWIN等系统，该系统中的pTWIN1、pTWIN2等表达载体首先将编码亲和标签、内含肽以及目标蛋白的基因序列连接在一起，在合适的宿主系统中表达出一个标签-内含肽-目标蛋白的三联体，再采用几丁质亲和纯化及柱上切割的方式在某些理化因素作用下(如pH、温度的变化或者巯基化合物的加入)，在亲和层析柱上发生自切割纯化出目标蛋白。Roman S.Esipov等人利用几丁质亲和层析纯化对rhEGF进行纯化，1L发酵培养基中可纯化获得17mg目的蛋白(Productiom of recombinant human epidermal growth factor using Ssp dnaB mini-intein system，2008，61：1-6.)。该纯化方法采用的几丁质珠填料价格高昂，100ml填料2790元，且该填料仅能重复使用3-5次，对扩大化生产应用是一个很大的限制。另外，柱上切割会导致目的蛋白的损失，试验中发现采用NEB公司的pTWIN1和pTWIN2载体表达蛋白的过程中，目的蛋白与内含肽之间存在自动裂解或不能控制性的裂解，柱上切割之前就有目的蛋白的损失，从而导致获得的蛋白质产量较低。因此，找到替代几丁质珠亲和层析和柱上切割法纯化内含肽介导的重组人表皮生长因子是Ssp内含肽介导的纯化技术能否扩大化生产重组人表皮生长因子的关键。

发明内容