[发明专利]一种重组人表皮生长因子的新型制备方法

权利要求书

1.一种重组人表皮生长因子的新型制备方法，其特征在于：按照以下步骤依次进行：

1)将hEGF与内含肽、几丁质结合域融合表达，表达载体为pTWIN1或pTWIN2，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)或ER2566；

2)将表达融合蛋白的宿主细胞破碎后，离心获得沉淀，融合蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，包涵体经洗涤、溶解、复性后，通过液相切割诱导内含肽自切割位点释放hEGF蛋白，再通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析纯化获得纯度大于97％的不含有多余氨基酸的hEGF蛋白。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述权利要求1步骤1)中hEGF、内含肽和几丁质结合域融合表达的连接顺序为几丁质结合域-内含肽-hEGF。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：

所述权利要求1步骤2)中的重组人表皮生长因子的切割方法为具有自切割功能的内含肽的自切割。

4.如权利要求3所述的重组人表皮生长因子的制备方法，其特征在于：所述的具有自切割功能的内含肽为Ssp DnaB。

5.如权利要求1所述的重组人表皮生长因子的制备方法，其特征在于：所述权利要求1步骤2)中的重组人表皮生长因子的切割方法为液相切割，即通过降低复性缓冲液pH值，室温诱导Ssp DnaB内含肽自切割，释放出hEGF。

6.如权利要求5所述复性缓冲液初始pH值为8.0-10.0；降低后的复性缓冲液pH值为6.0-7.0。

7.如权利要求1所述的重组人表皮生长因子的制备方法，其特征在于：所述权利要求1步骤2)中硫酸铵分级沉淀的纯化方法为10％-40％硫酸铵溶液除 去杂蛋白，60％-80％硫酸铵溶液沉淀hEGF。

8.如权利要求1所述的重组人表皮生长因子的制备方法，其特征在于：所述权利要求1步骤2)中的重组人表皮生长因子的纯化方法为阴离子交换层析，优选DEAE琼脂糖阴离子交换层析。