[发明专利]无选择标记残留的乳酸菌基因组基因操作系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因操作系统及其应用，特别涉及一种新型的无选择标记残留的乳酸菌基因组基因操作系统及其应用。属于生物技术领域。

背景技术

乳酸菌作为人和动物肠道主要的益生菌群之一，在食品和发酵工业中的长期应用早已证明其安全级特性，其具有许多健康功效，乳酸菌能非特异性提高人和动物的免疫力，特别是在提高人和动物的胃肠道粘膜免疫功能方面，乳酸菌产生的乳酸菌素、细菌素、乳酸和其它多种有机酸类均具有抑菌、抗腹泻作用，在调节肠道菌群失调，增强肠道粘膜免疫功能，预防肠道传染性疾病中发挥重要作用；乳酸菌本身对黏膜有良好的黏附和肠道定植功能，并且乳酸菌细胞壁的胞壁酰二肽亦具有免疫佐剂作用等。乳酸菌的这些益生特点，使其作为良好的表达外源抗原的动物生态活载体在探索特异性抗原传递和诱导黏膜免疫应答方面有其独特的优势和潜在的应用价值。

通过乳酸菌携带的质粒插入外源基因转化乳酸菌作为抗原传递系统进行人和动物的粘膜免疫已在某些方面取得了可喜进展，许多研究揭示了乳酸菌质粒传递系统可表达外源抗原并能诱导特异性的局部黏膜和系统免疫应答，为利用乳酸菌的益生功能和特异性的疾病预防奠定了重要的理论和实践基础。

但利用质粒系统进行外源抗原的表达存在很多缺陷，如乳酸菌质粒表达系统对外源抗原的表达量明显低于大肠杆菌表达系统；质粒表达存在不稳定性；质粒在细菌增殖过程中可发生丢失现象；质粒在细菌间的传递尤其是质粒中存在抗性基因使乳酸菌作为人和动物疫苗存在着重大生物安全隐患。因此，如何实现乳酸菌对外源基因的稳定、高效表达以及重组乳酸菌绝对不能携带有包括抗性基因在内的任何选择标记和多余碱基，完全符合生物制品生物安全评价标准，又能达到真正意义上的食品安全级乳酸菌活载体标准的要求，并能有效递呈目的抗原、增强抗原特异性的黏膜免疫应答，是当前需要进一步攻克的基础科学问题，显然乳酸菌的基因组的插入和缺失操作，尤其是无任何选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统就具有十分重大的现实意义。

随着现代生物技术的巨大进步，已发展了多种基因操作技术在乳酸菌染色体水平上进行基因的缺失和插入操作。随着乳酸菌分子遗传学理论研究的深入，多种益生性乳酸菌的全基因组序列的测定、乳酸菌相关基因的结构与功能有了清晰的认识，为进一步实现乳酸菌染色体基因敲除和外源基因的插入及其稳定表达奠定了基础。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明所要解决的技术问题是提供了一种新型无任何选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于包括一个辅助质粒、一个用于构建基因打靶主质粒的中间质粒和一个作为基因操作基础的乳酸菌菌株；

其中所述辅助质粒含有一个宽宿主范围穿梭型红霉素抗性基因和一个温度敏感型及宽宿主范围穿梭型完整的pWV01复制子；

其中所述用于构建基因打靶主质粒的中间质粒含有一个宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因、一个温度敏感型及宽宿主范围穿梭型完整pWV01复制子和一个表达尿嘧啶磷酸核糖转移酶（uracil phosphoribosyl transferase,UPP）基因的宽宿主范围穿梭型表达盒；

其中所述的基因操作基础乳酸菌菌株为缺失尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因（upp）的任意乳酸菌菌株。

在本发明中，优选的，所述辅助质粒依次含有大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围表达的穿梭型红霉素抗性基因Emr、温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的pWV01复制子。

本发明中，优选的，所述用于构建基因打靶主质粒的中间质粒依次含有大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围表达的穿梭型氯霉素抗性基因Cmr、一个温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整pWV01复制子、一个表达尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的宽宿主范围表达盒p32upp。

本发明中，优选的，所述的乳酸菌菌株为缺失upp基因的完整开放阅读框，但保留了upp基因的原始启动子和终止子的乳酸菌菌株。