[发明专利]一种免疫类毒素的制备方法

权利要求书

1.一种免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述方法如下：

（1）以蟾蜍的鲜品或干品为原料，破碎或粉碎；

（2）然后加入纯净水搅拌均匀，固液比为1kg：2～30L，加入0.1～100g胰蛋白酶，在25～50℃酶解4～48h；

（3）用分离机以3000～15000r/min分离上述酶解物，收集的液体用缓冲液调pH=7.0～9.0，控制温度为25～45℃，加1～100g戊二醛或甲醛脱毒处理30～60d，成为免疫脱毒液粗品；

（4）将1kg免疫脱毒液粗品加入氨水调pH=8～10，再加入100～300g硫酸铵及10～500g活性白土，常温条件下生成沉淀并放置1～24h；

（5）上述物料用膜孔径0.2～10μm微孔过滤机过滤并且用膜孔径8～120nm超滤机超滤处理，收集超滤液；

（6）收集的超滤液注入到分离柱中，在压力0.2～5Mpa、流速10～500mL/min条件下分离纯化得免疫类毒素；

（7）分离纯化的免疫类毒素用氢氧化铝溶液或磷酸钙溶液吸附，常温条件吸附时间12～24h，成为稳定性免疫类毒素。

2.根据权利要求1所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述蟾蜍为中华大蟾蜍、黑眶大蟾蜍、花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍。

3.根据权利要求1或2所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述蟾蜍为2～4龄。

4.根据权利要求1所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述缓冲液由0.2mol/L磷酸氢二钠与0.1mol/L柠檬酸组成。

5.根据权利要求1所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述缓冲液由0.2mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄组成。

6.根据权利要求1所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述分离柱为SephadexG75、SephadexG100或SephadexG150。

7.根据权利要求1所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述制备方法具体步骤如下：

（1）选用中华大蟾蜍或黑眶大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍的干品用粉碎机粉碎至过100～150目筛，收集粉末；

（2）将1000g粉末放入微波炉中以功率1000～2500W，加热1～20min杀菌处理，然后自然冷却至室温；

（3）上述冷却至室温的粉状物加入2～20L纯净水混合均匀后，加入0.1～50g胰蛋白酶，保持温度25～50℃，酶解4～48h；

（4）用分离机以3000～15000r/min分离上述酶解物，收集的液体用0.2mol/L磷酸氢二钠与0.1mol/L柠檬酸组成的缓冲液调pH=7.0～9.0，控制温度为35～45℃，加1～100g戊二醛脱毒处理30～60d，成为免疫脱毒液粗品；

（5）将1kg免疫脱毒液粗品加入氨水调pH=8～10，再加入100～300g硫酸铵及10～200g活性白土，常温条件下生成沉淀并放置1～24h；

（6）上述物料用膜孔径0.2～10μm微孔过滤机过滤并且用膜孔径8～120nm超滤机超滤处理，收集超滤液；

（7）收集的超滤液注入到SephadexG75或SephadexG100分离柱中，在压力2～5Mpa、流速10～500mL/min条件下分离纯化得免疫类毒素；

（8）分离纯化的免疫类毒素用1～15mg/mL氢氧化铝溶液或1～10mg/mL磷酸钙溶液吸附，常温条件吸附时间12～24h，成为稳定性免疫类毒素。

8.根据权利要求1所述的免疫类毒素的制备方法，其特征在于所述方法具体步骤如下：

（1）选用2～4龄中华大蟾蜍或黑框大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍，在温度-10～-30℃冷冻，用绞肉机绞碎再用磨浆机磨成浆；

（2）在膨胀溶剂体系提取装置中，1kg浆体加入2～20kg甲醇或乙醇或乙酸乙酯，充入10～50kg二氧化碳，加压至0.2～10Mpa，常温条件下保持时间30～120min，然后降压至常压；

（3）用分离机以3000～15000r/min分离上述物料，收集固形物；

（4）1kg固形物加入10～30L纯净水搅拌均匀，加入1～100g胰蛋白酶，在25～50℃酶解5～48h；

（5）用分离机以3000～15000r/min分离上述酶解物，收集浆液，用0.2mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液调整pH=7.0～7.6，控制温度25～45℃，加10～100g甲醛脱毒30～60天，成为免疫类毒素粗品；

（6）将1kg免疫类毒素粗品加入氨水调整pH=8～9，再加入200～300g硫酸铵及10～500g活性白土，常温条件下沉淀并放6～24h；

（7）上述物料用膜孔径0.2～10μm微滤机过滤并且用膜孔径8～120nm超滤机超滤处理；

（8）将超滤液注入到SephadexG75或SephadexG150分离柱中，在压力0.2～1.0Mpa、流速100～500mL/min条件下分离纯化成免疫类毒素；

（9）将纯化免疫类毒素用1～10g/L氢氧化铝溶液或1～50g/L磷酸钙溶液吸附，常温条件下吸附12～24h成稳定性免疫类毒素。