[发明专利]一种马槟榔愈伤组织的诱导及再生方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物组织的培养方法，具体涉及一种马槟榔愈伤组织的诱导及再生方法。

背景技术

马槟榔（C.masaikai），系山柑科（Capparidaceae），山柑属植物；是一种多年生常绿木质藤本、攀援灌木，长达数米至数十米；仅分布于我国热带亚热带地区，如云南、广西和贵州等省区的高海拔（800-1600m）地区；是一种珍稀濒危野生果树。

马槟榔种子可入药，其性苦、甘、寒，可催产、避孕；可清热解毒、治咽喉肿痛、恶疮肿毒；可生津润肺、助消化；还可去斑痧、醒酒等，特别是其种仁食之有经久甜味。其种子富含甜蛋白，在全世界7种植物甜蛋白中，马槟榔是我国特有分布的、唯一在果实中富含甜蛋白的野生果树资源。其种仁中富含甜蛋白马宾灵(mabinlin)，甜度约为蔗糖的400倍（以重量比较为基础），而且其耐酸性好，热稳定性高，即使在85℃水浴中48h都不改变其甜味活性，pI为11.3，在酸性体系中仍保持可溶性，因此有望成为一种新型食品甜味剂。

马槟榔为高大木质藤本植物，仅海南琼海有人以种子育苗试种植，此外，基本上属于野生自然繁殖的状态，加上自然生境的破坏及人为的砍伐，数量已十分稀少。目前，国内外对马槟榔的研究主要是在成分分析和甜蛋白基因等方面，其次就是形态学的研究，在马槟榔的育种方面的研究较少，繁殖方法也只是停留在种子育苗的状态，致使对它的开发与利用受到很大的限制，难于满足人工种植和实验室的深入研究的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种马槟榔愈伤组织的诱导及再生方法，该方法不仅能够保证株系的优良特性，并能够提供大量的优质种苗，为马槟榔大面积种植、生态与物种保护、资源利用及实验提供了良好的诱导及再生方法。

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：

一种马槟榔愈伤组织的诱导及再生方法，含以下步骤：(1)材料的选取与消毒；(2)愈伤组织诱导；(3)丛生芽诱导；(4)丛生芽的增殖培养；(5)不定芽的生根成苗。

具体的，本发明提供的马槟榔愈伤组织的诱导及再生方法，含以下步骤：(1)材料的选取与消毒选取马槟榔材料，将材料经含清洗和浸泡消毒工序处理，获得处理后的马槟榔材料；

(2)愈伤组织诱导将处理后的马槟榔材料切块，获得组织块，将组织块接种于愈伤组织诱导培养基上于26~28℃进行暗培养20~60天，获得马槟榔愈伤组织块；

(3)丛生芽诱导将马槟榔愈伤组织块连同马槟榔愈伤组织块中未愈伤的组织块，转接于丛生芽的诱导培养基上于26～28℃进行光培养20~40天，获得马槟榔丛生芽组织块；

(4)丛生芽的增殖培养：选取长势较好的马槟榔丛生芽组织块进行切块，去除已死去变黑和变褐的组织，接种于丛生芽增殖培养基上于26～28℃进行光培养30~60天，获得大量的马槟榔不定芽；

(5)不定芽的生根成苗：选取马槟榔不定芽接到生根成苗培养基上于26～28℃进行光培养30～60天，获得马槟榔的小苗。

在上述步骤中：

本发明步骤(1)中所述的马槟榔材料包括马槟榔未成熟胚、成熟胚、嫩茎和嫩叶材料中的一种或几种。

本发明步骤(1)中将马槟榔材料经含清洗和浸泡消毒工序处理的过程如下：选取马槟榔材料，用水清洗干净，将马槟榔材料置于体积百分含量为70~75%的酒精中消毒10~60s，并在质量百分含量为0.1%的氯化汞中浸泡消毒3~20min，用无菌水冲洗干净即可，浸泡期间进行不时振荡，使马槟榔材料与酒精或氯化汞充分接触。

本发明步骤(2)中将处理后的马槟榔材料切块，获得长度为1.0~2.0cm的组织块。

本发明步骤(2)中愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基础培养基，在每1升MS培养基中还添加有1~5mg的6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、0.1~0.5mg的NAA（萘乙酸）和20~30g的蔗糖。

本发明采用愈伤组织诱导培养基培养后，最高的出愈率可达85%，愈伤组织较好，浅绿色、较紧密、且有光泽，并有芽萌动的现象；随着6-BA浓度在一定范围内的逐步增加，愈伤组织形成速度逐步加快，而在此基础上添加一定量的NAA会使产生的愈伤组织变得稍微疏松，并能直接诱导产生不定芽。

本发明步骤(3)、步骤（4）和步骤（5）中光培养时，每天光照的时间最好为10~12h；每天光照10～12h有利于丛生芽的诱导，诱导出多个不定芽，且芽生长健壮，颜色鲜绿，可用于进一步的增殖培养。