[发明专利]补体H因子用作甲基苯丙胺成瘾患者的基因表达产物中的应用

权利要求书

1.补体H因子(Complement factor，CFH)用作甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)成瘾相关人群的基因表达产物中的应用。

2.人血清中CFH含量表达上调用于鉴定或确认METH成瘾相关人群的方法中的应用，优选所述的人血清中CFH含量选自CFH绝对含量、CFH相对含量的任一种或其组合，更优选所述的CFH相对含量为血清中CFH相对于血清总蛋白的质量百分比。

3.免疫印迹法用于定量检测人血清中CFH蛋白含量的方法中的应用。

4.一种用于双向电泳(2-DE)分析的血清样品的预处理方法，包括下述步骤：

1)静脉穿刺，分别抽取METH成瘾患者组和正常对照组的血液样品；

2)将抽取的待测血液样品置于4℃下，3,000g转速离心10min，分离血清，再用白蛋白/IgG去除试剂盒去除血清中的白蛋白和IgG，即得。

5.一种血清差异表达蛋白的鉴定方法，包括下述步骤：

1)分别抽取METH成瘾患者组和正常对照组的血清样品，将其使用白蛋白/IgG去除试剂盒去除血清中的白蛋白和IgG，获得待测血清样品；

2)将待测血清样品采用双向电泳进行分离，包括第一向等电聚焦电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺电泳，得到蛋白分离凝胶；

3)将步骤2)得到的蛋白分离凝胶进行硝酸银染色，得到METH成瘾患者组和正常对照组的血清样品的双向电泳图谱；

4)将步骤3)中得到的双向电泳图谱进行比对，选取变化稳定(重复3次及以上)、分离度较好、易切取的蛋白质斑点，斑点切下后，经过脱色和酶切后，进行生物质谱分析，得到蛋白质斑点的肽质量指纹图谱；

5)将步骤4)得到的蛋白质斑点的肽质量指纹图谱在SwissProt蛋白序列数据库中检索，得到差异表达蛋白质的名称及其相关信息。这些差异高表达的蛋白是补体因子H(Complement factor H，CFH)，α1酸性糖蛋白2(Alpha-1-acid glycoprotein 2)，转甲状腺素蛋白(Transthyretin)，载脂蛋白L1(Apolipoprotein L1)，和结合珠蛋白(Haptoglobin)。

6.根据权利要求5所述的鉴定方法，所述的对照样品包括空白调零对照、空白对照、标准对照的任一种，其中，空白调零对照为加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物及终止溶液的对照样品，用于检测时调零OD值；空白对照为加入稀释液的对照样品；标准对照为加入已知浓度的CFH蛋白标准样品的对照样品。

7.一种酶联免疫试剂盒，所述试剂盒由包被CFH蛋白的特异性多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、CFH蛋白的特异性多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗CFH多克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、底物和终止液，其中，所述的封闭液为含1％牛血清白蛋白的PBST溶液，所述的样品稀释液为0.01M Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液，所述抗原标准品为纯化的重组人CFH蛋白抗原，所述的浓缩洗涤液为25×PBST缓冲液，所述的底物为过氧化氢-四甲基联苯胺，所述的终止液为酸溶液，优选为2M的硫酸溶液。

8.一种夹心式酶联免疫法定量检测人血清CFH蛋白的方法，所述的方法包括下述步骤：

1)将血清样品用0.01M Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液稀释20-50倍(优选稀释为30倍)，制得待测样品；

2)将对照样品和待测样品分别加入包被了浓度为100ng/mL-20ug/mL人CFH蛋白的特异性多克隆抗体的微孔板上的微孔中，振摇，使CFH蛋白与人CFH蛋白的特异性多克隆抗体充分结合；

3)用PBST缓冲液冲洗微孔板，去除未结合的其他组分后，加入以封闭液稀释的CFH蛋白特异性多克隆抗体稀释液，充分结合；

4)弃去孔内液体后，用PBST缓冲液冲洗，去除未结合的抗体及其它组分，加入以封闭液稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗CFH多克隆抗体的二抗，充分结合；

5)弃去孔内液体后，用PBST缓冲液冲洗，去除未结合的抗体及其它组分，HRP标记的抗体后，加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物，与HRP反应；

6)加入终止液，使反应停止，在450nm波长处，测定黄色反应产物的吸收度，获得CFH蛋白的绝对含量。