[发明专利]一种基于金磁微粒的电化学发光免疫分析方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检验领域，具体涉及电化学发光免疫分析技术。

背景技术

人体中某种抗原/抗体的浓度可能与其的健康状况、生理机能、生理周期等有直接的关系，所以定量检测人体中抗原/抗体的浓度对人体意义重大。如人体血清中PSA的浓度在前列腺癌的诊断、预后判断和疗效检测等方面具有重要意义。目前人体血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中的抗原/抗体的检测技术主要有：放射免疫分析技术(Radioimmunoassay,RIA)、酶联免疫分析技术(Enzyme linked Immunosorbent Assay，ELISA)、荧光免疫分析(Fluorescence Immunoassay,FIA)、化学发光疫分析技术(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)、免疫层析技术(Lateral Flow Immunoassay，LFIA)等方法，但这些方法都有各自的优点与不足，而电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescence Immunoassay，ECLIA)是化学发光免疫分析的一种衍生技术，是目前最先进的标记免疫分析技术，它继承了化学发光免疫分析技术的全部优点，弥补了化学发光免疫分析技术的缺陷，拓展了化学发光免疫分析技术的应用空间，并以其独特的优势备受广大科研工作者、医务工作者和患者的青睐。

电化学发光免疫分析包括两个部分，分别为免疫反应系统和电化学分析系统。免疫反应系统是用电化学发光标记物标记抗原或抗体，然后经过免疫反应和一系列操作步骤形成免疫复合物待检的过程；电化学分析系统是免疫复合物上的电化学发光物质在工作电极表面发生电化学发光，利用发光测量仪器检测发光强度，从而对抗原或抗体进行检测的过程。

与其他技术相比电化学发光免疫分析技术主要有如下优势：1)灵敏度高，线性范围宽，检测灵敏度和线性范围可达到或超过放射免疫分析；2)试剂稳定，无毒无放射性危害；3)稳定性好，自动化程度高；4)检测速度快；5)应用范围广。目前电化学发光免疫分析技术已被广泛用于激素、肿瘤标志物、乙肝各项指标及其他物质如维生素、叶酸、DNA、RNA、免疫球蛋白等的检测。但是，传统电化学发光免疫分析方法中涉及抗原/抗体的生物素化、用功能化基团修饰磁微球等过程，步骤繁琐，成本较高。

发明内容

本发明提供了一种基于金磁微粒的电化学发光免疫分析方法，实现定量检测人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中的抗原/抗体的含量，以解决现有技术成本较高、步骤繁琐、反应可控性差、不具有通用性等问题。

为实现以上发明目的，本发明给出的基础技术方案如下：

1、一种基于金磁微粒的电化学发光免疫分析方法，包括以下步骤：

1)用金磁微粒制备免疫磁珠

采用偶联缓冲液稀释与待测对象相应的捕获抗体/抗原，得到捕获抗体/抗原溶液；移取金磁微粒(尤其以平均粒径小于5μm，饱和磁化强度大于40A·m²/kg的金磁微粒为佳)于离心管中，加入偶联缓冲液轻摇混匀，磁性分离弃上清；取所述捕获抗体/抗原溶液加入装有所述金磁微粒的离心管中，轻摇混匀，将离心管固定于恒温摇床反应，待反应完毕磁性分离弃上清，将清洗缓冲液加入该离心管中轻摇混匀，磁性分离弃上清；在该离心管中加入封闭剂，并将其置于恒温摇床中振荡反应，反应结束后磁性分离弃上清；最后加入保存缓冲液，轻摇混匀，制得免疫磁珠。

2)Ru(bpy)₃²⁺标记检测抗体/抗原

另取对应于所述捕获抗体/抗原的检测抗体/抗原，用标记缓冲液进行充分透析；取Ru(bpy)₃²⁺-NHS ester将其溶解于DMSO(二甲亚砜)中；调整检测抗体/抗原与Ru(bpy)₃²⁺-NHS ester的摩尔比，使其达到最佳标记比例；将两者混合加入离心管中，在恒温振荡器里避光反应；待反应结束向上述离心管中加入100μL、2M的甘氨酸溶液，继续避光反应10min以终止反应；将离心管中的反应物用保存缓冲液避光透析；透析后即得到Ru(bpy)₃²⁺标记的抗体/抗原，保存备用。

3)定量测定抗原/抗体标准曲线的建立