[发明专利]一种基于金磁微粒的电化学发光免疫分析方法

权利要求书

1.一种基于金磁微粒的电化学发光免疫分析方法，包括以下步骤：

1)用金磁微粒制备免疫磁珠

采用偶联缓冲液稀释与待测对象相应的捕获抗体/抗原，得到捕获抗体/抗原溶液；移取金磁微粒于离心管中，加入偶联缓冲液轻摇混匀，磁性分离弃上清；取所述抗体/抗原溶液加入到所述装有金磁微粒的离心管中，轻摇混匀，将离心管固定于恒温摇床中振荡反应，待反应完毕后磁性分离弃上清，将清洗缓冲液加入到该离心管中轻摇混匀，磁性分离弃上清；在该离心管中加入封闭剂，并将其置于恒温摇床中振荡反应，待反应结束后磁性分离弃上清；最后加入保存缓冲液，轻摇混匀，制得免疫磁珠，保存备用；

2)用Ru(bpy)₃²⁺标记抗体/抗原

另取对应于所述捕获抗体/抗原的检测抗体/抗原，用标记缓冲液进行充分透析；取Ru(bpy)₃²⁺-NHS ester并将其溶解于DMSO中；调整检测抗体/抗原与Ru(bpy)₃²⁺-NHS ester的摩尔比，使其达到最佳标记比例；将两者混合加入离心管中，在恒温摇床中避光反应；待反应结束向上述离心管中加入100μL、2M的甘氨酸溶液，继续避光反应10min以终止反应；将离心管中的反应物用保存缓冲液避光透析；透析后即得到Ru(bpy)₃²⁺标记的抗体/抗原，保存备用；

3)定量测定抗原/抗体的标准曲线的建立

取多支反应管，分别向每支反应管中加入定量的所述免疫磁珠、不同浓度的抗原/抗体标准品、所述Ru(bpy)₃²⁺标记的抗体/抗原，将其置于恒温摇床中反应，形成磁性免疫复合物：

免疫磁珠-抗原-Ru(bpy)₃²⁺标记的抗体免疫复合物；

免疫磁珠-抗体-Ru(bpy)₃²⁺标记的抗原免疫复合物；

免疫磁珠-抗原-抗体-Ru(bpy)₃²⁺标记的二抗免疫复合物；

清洗并重悬免疫复合物，再将其加入到电化学发光免疫分析仪的检测室，同时引入含TPA的ECL缓冲液，然后启动电化学发光反应，记录发光值，制作标准曲线；

4)检测待测样品

取反应管，加入定量的所述免疫磁珠、待测样品、所述Ru(bpy)₃²⁺标记的抗体/抗原，将其置于恒温摇床中反应，形成所述免疫复合物；清洗并重悬该免疫复合物，然后再将其加入到电化学发光免疫分析仪的检测室，同时引入含TPA的ECL缓冲液，启动电化学发光反应；记录发光值，通过所述标准曲线计算待测样品中抗原/抗体的浓度。

2.根据权利要求1所述的电化学发光免疫分析方法，其特征在于：

步骤2)中的标记缓冲液为0.005～0.1M，pH 8～10的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液；

步骤2)中所述检测抗体/抗原与Ru(bpy)₃²⁺-NHS ester的摩尔比1:10～1:100；待标记的检测抗体/抗原的浓度应调至0.1～10mg/mL；

步骤3)中所述ECL缓冲液为0.005～0.1M，pH 7～9的PB缓冲液，含0.05%～0.1%TritonX-100，0.05%～0.1%Tween20，0.1%NaN₃，100mM TPA。

3.根据权利要求2所述的电化学发光免疫分析方法，其特征在于：

步骤1)中所述偶联缓冲液为0.005～0.1M，pH 6～8的Tris-HCl缓冲液；封闭剂的配方为：1%～10%BSA，1%～5%小牛血清，0.1%～2%PEG20000。

4.根据权利要求2所述的电化学发光免疫分析方法，其特征在于：步骤1)和2)中所述保存缓冲液为0.005～0.1M，pH 6～8的PB缓冲液，含0.1%～1%NaN₃。

5.根据权利要求2所述的电化学发光免疫分析方法，其特征在于：步骤1)和2)恒温摇床的转数为100～180rpm，温度为20～37℃。

6.根据权利要求2所述的电化学发光免疫分析方法，其特征在于：步骤1)和3)中所述清洗缓冲液为0.005～0.1M，pH 6～8的PBST。