[发明专利]一种提取分离趋磁细菌中磁小体的超临界二氧化碳方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地讲，涉及一种从趋磁细菌中提取纳米磁小体的一种新方法。

背景技术

趋磁细菌是能够沿着地球磁场，或者外加磁场方向定向运动或排列的一类水生生物细菌。这类细菌能够合成具有生物膜包被、单磁畴级晶体的磁性颗粒，这种颗粒被称为磁小体。磁小体具有成分纯、形态独特、细小均匀、有外膜包被等特点。由于其具有巨大的表面积和体积比、无细胞毒性、不易发生团聚以及独特的生物学特性，使得该纳米级的磁性颗粒在生物工程、磁记忆材料、化工、医药卫生等方面有着广阔的应用前景。

有关这种磁性颗粒的提取纯化方法的文献较少，到目前为止，已经报道的提取分离磁小体的方法有以下几种：（1）用溶菌酶或NaOH溶解（参见Noriyuki Nakamura, Kohji Hashimoto, and Tadashi Matsunaga. Immunoassay Method for the Determination of Immunoglobulin G Using Bacterial Magnetic Particles. Anal.Chem.1991, 63: 268–272）；（2）用细胞压榨仪破壁；（3）过滤离心法（参见申请号为CN02115867.3的中国专利申请，一种淤泥趋磁细菌及其分离纯化和制备磁小体的方法，和申请号为CN02115868.1的中国专利申请，一种铁矿趋磁细菌及其分离纯化和制备磁小体的方法）；（4）反复冻融法（参见申请号为CN200510019607.5的中国专利申请，一种兼性厌氧趋磁细菌及其分离、纯培养方法和磁小体的提取、纯化方法）；（5）超声波破壁（参见申请号为CN03153488.0的中国专利申请，趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法）；（6）破壁后采用磁场分离的方法收集磁性颗粒。

上述几种方法都无法除去有免疫原性的一些物质，再者用溶菌酶和NaOH破壁提取的磁性颗粒的外膜已被破坏，容易引起团聚；而用超声波破碎提取磁小体后，超声波打击可能会使磁小体膜上的结合蛋白脱落（参见付刚，姜伟，李颖等，磁螺菌磁小体形成的电镜观察及其纯化，China Journal of Modern Medicine.2004，14(5)：45–49）。传统生物方法提取的磁小体存在生产周期长、单分散性差、稳定性不好、残留杂质不容易去除、产量较低等问题。

超临界二氧化碳流体是一种环境友好型溶剂，不仅具有液体的高密度、强溶解性、优良的溶剂特性和高传热系数的性质，而且有近似于气体的粘度和扩散系数，在临界点附近，超临界二氧化碳流体的物性随温度和压力的变化十分敏感。由于超临界二氧化碳的特殊性质，在完成溶剂功能后易于与产物分离且不造成环境污染，使得超临界二氧化碳流体技术在萃取分离、化学反应工程、生物工程、石油化工、环境保护等领域都有广泛应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种采用超临界二氧化碳法从趋磁细菌中萃取分离磁小体的方法，采用此方法萃取分离获得的磁小体具有粒径小、单分散性好、稳定性高、无有机溶剂残留、饱和磁化强度高、萃取分离效率高等特征。

为了解决上述问题，本发明提供了一种提取分离趋磁细菌中磁小体的超临界二氧化碳方法，包括以下步骤：

（1）有机溶剂预处理：离心收集菌体，将菌体细胞转移至烧杯中，用体积比为2:1的氯仿和甲醇溶液溶解菌体细胞，振荡摇匀，待样品颜色由淡黄色变为乳白色；

（2）超临界CO₂萃取和有机溶剂的去除：加入重蒸水于上述烧杯中，磁力搅拌使其形成混悬液，将上述混悬液加入到超临界二氧化碳反应釜中，并将反应釜放入35—60℃的恒温水浴中稳定，在反应釜中通入二氧化碳气体，在反应釜温度为35—60℃和压力为10—25Mpa条件下，搅拌萃取一个小时，然后将恒温水浴温度降至室温，缓慢释放二氧化碳气体使体系压力降为常压，在反应釜中获得磁小体；

（3）水溶性残留物的去除：将萃取出的磁小体倒入烧杯中，将一磁铁固定在烧杯一侧，静置，待磁性颗粒的黑色沉淀全部聚集在放磁铁的一侧后，弃去上清，用重蒸水洗涤至少3次。

步骤（2）中通过缓慢释放二氧化碳气体使有机溶剂和菌体细胞的有机残留物一同除去，步骤（3）中通过纯化将水溶性残留物去除。

作为一个优选，最佳的超临界二氧化碳流体的温度、压力条件为：步骤（2）恒温水浴的温度为60℃，反应釜的温度为60℃，压力为20Mpa。