[发明专利]间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和免疫学技术领域，特别是一种间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法，所得单克隆抗体可应用于酶联免疫法检测间日疟原虫，也可作为间日疟原虫快速诊断试剂盒的一部分。

背景技术

疟疾广泛流行于热带和亚热带发展中国家，是一种由蚊媒传播的严重危害人类健康的寄生虫病。间日疟原虫对人类的危害仅次于恶性疟原虫，据估计全球收到间日疟原虫感染的人口高达26亿，每年约有0.8~3亿的人口因受到间日疟原虫感染而急性发作，在我国，2000年后疟疾疫情呈上升趋势，每年估计有70万左右疟疾患者，其主要是间日疟患者，尽管2007年后疫情得到遏制，但是其流行程度仍然处于上升趋势。

采用传统的厚血膜镜检费时费力，检测效率低下，近年来，核酸检测方法在疟疾诊断中得以应用，虽然该方法具有高度的特异性和敏感性，但是技术要求较高，需要技能熟练的操作员，阻碍了该方法的进一步普及。因此，寻求灵敏特异，简便快速的疟疾诊断方法在当前疟疾防治工作中显得尤为重要。开发具有高灵敏度、高特异性的间日疟抗体是建立间日疟体外诊断技术的首要任务。

间日疟原虫的宿主只有两个，人和按蚊。通过中间宿主按蚊传播疾病，被感染的人患疟疾。其生活史分为三个时期：红细胞外期、红细胞内期和红细胞期，只有红细胞内期发生在红细胞内，其余两个发生在肝细胞中。

疟疾特异性检测（RDTs）是一种可以检测疟疾寄生虫特异性抗原的横向层析方法。RDTs方法提高了疟疾诊断和实例诊断的准确性，尤其是当镜检不可用或者不可靠的情况下。市场上已经有很多种RDT产品可以购买，其中一些是只可以检测恶性疟原虫，而其他的一些可以检测恶性疟原虫同时检测出一种甚至三种以上的人源疟疾。RDTs检测中主要是以HRPⅡ和疟原虫乳酸脱氢酶为靶抗原来检测恶性疟原虫，然而疟原虫pan-specific乳酸脱氢酶和醛缩酶通常被当作检测另外三种疟原虫的靶抗原。醛缩酶是疟原虫糖酵解过程中的关键酶。与高等脊椎动物拥有三种醛缩酶（同工酶）不同的是，间日疟原虫和恶性疟原虫拥有同一种醛缩酶，与锥体虫和贾第虫类似。间日疟原虫和恶性疟原虫的醛缩酶都含有390个氨基酸，他们的核苷酸和氨基酸序列的相对保守。因此，本申请选用醛缩酶作为靶抗原，分析其序列，选择其优势抗原表位，筛选反应灵敏度高，特异性强的单克隆抗体，以降低以HRPⅡ和疟原虫乳酸脱氢酶为靶抗原可能出现的漏检风险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种间日疟原虫醛缩酶(aldolase)蛋白单克隆抗体的制备方法。由该方法所得的间日疟单克隆抗体反应灵敏度高，特异性强，成本低，可大规模制备作为商品化检测试剂盒的原料。

间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用柔性片段GGCAGCGGCAGCGGC将间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位A、B、C相连接，得到重组子D；其中，

抗原表位A的核酸序列为：GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCT；

抗原表位B的核酸序列为：ATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTA GGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACC；

抗原表位C的核酸序列为：AACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGG GAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT；