[发明专利]间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用柔性片段GGCAGCGGCAGCGGC将间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位A、B、C相连接，得到重组子D；其中，

抗原表位A的核酸序列为：GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCT；

抗原表位B的核酸序列为：ATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTA GGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACC；

抗原表位C的核酸序列为：AACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGG GAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT；

重组子D的核酸序列为：GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCTGGCAGCGGCAGCGGCATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTAGGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACCGGCAGCGGCAGCGGCAACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGGGAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT；

（2） 将重组子D和载体PET-28a（+）用BamHI和XhoI进行双酶切，将重组子D连接到载体PET-28a（+）上，转化大肠杆菌BL21，筛选得到重组蛋白D表达菌株；

（3） 诱导表达重组蛋白D：重组蛋白D的氨基酸序列为：GluGlyIleIleProGlyIle LysValAspLysGlyLeuValThrIleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAlaGlySerGlySerGlyIleGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerIleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThrGlySerGlySerGlyAsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGlyAlaAspAlaGlyAlaSerLeu；

（4）将获得的重组蛋白D超声破碎并低温离心，溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，洗脱得到纯化重组蛋白D；

（5）用纯化后重组蛋白D免疫Balb/c小鼠，多次免疫尾静脉采血测定血清效价后，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，并用HAT筛选得到稳定的杂交瘤细胞株；

（6）将杂交瘤细胞株注射到液体石蜡预处理的F1小鼠腹腔，隔周取腹水，50%饱和硫酸铵沉淀法和Protein G亲和纯化单抗，得到单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位A的氨基酸序列为：GluGlyIleIleProGlyIleLysValAspLysGlyLeuValThrIlePro CysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAla。