[发明专利]高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂及其裂解方法、用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的裂菌制剂的制备方法，具体涉及一种高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂及其裂解方法、用途。

背景技术

大肠杆菌主要寄生在人和动物的肠道内，大多数是肠道的正常菌群，但在特定的条件下可成为致病菌，致肠道内致病和肠道外致病，表现为腹泻、出血性肠炎、败血症、禽类的气囊炎、关节滑膜炎和肉芽肿等。其中肠道内致病的典型血清型代表是O157，它是肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）的一个主要血清型，是食源性人兽共患病原菌，它可通过污染的食品而引起人的食物中毒，严重的可致人死亡，因此研制杀灭大肠杆菌的高效制剂在公共卫生方面具有重要的意义。

目前能够杀灭细菌的主要包括多种消毒剂、防腐剂、抗生素、抗代谢物等。然而，随着这些药物的广泛应用，不但产生了大量的药物残留，细菌的多重耐药、高剂量耐药等也越来越严重，且细菌的耐药菌株的传播进一步加剧，从而增加了对环境和人类的威胁。因此科学家们一直在探索新的杀灭细菌的制剂。噬菌体是侵害细菌的病毒，不但能够介导宿主菌生物学特性的改变，还能够影响宿主菌的繁殖周期，决定宿主菌的溶原和裂解状态。裂解性噬菌体中裂解酶具有特异性水解宿主细菌细胞壁，破坏细菌细胞壁的完整性，从而杀灭细菌。噬菌体编码的裂解酶像噬菌体一样只能攻击特定的细菌，具有较高的特异性。而且裂解酶作用于细菌的速度极快，以致于细菌不会对该酶产生抗性，且噬菌体的裂解酶有比噬菌体更为广泛的抗菌谱，因此从噬菌体裂解酶的角度来筛选杀灭细菌的制剂，是目前抗菌制剂中的新方向。

迄今噬菌体裂解酶的研究主要集中在对革兰氏阳性菌的裂菌作用，例如链球菌、炭疽杆菌、结核分枝杆菌等的裂解酶的研究相对较多，而对革兰氏阴性菌，特别是大肠杆菌噬菌体裂解酶的研究尚未有报道。由于不同的噬菌体具有不同的裂解酶序列，即使是相同的基因序列在不同的噬菌体也会发挥不同的作用，且有的基因在体外表达还会受到很多条件的限制，从而阻碍了筛选真正具有裂菌作用的裂菌剂。本发明通过比较大肠杆菌O157噬菌体Min27的基因组系列，筛选多个特定的序列片段，通过修饰，进行原核表达、诱导和纯化，获得了有活性的裂菌制剂，可对多种血清型的大肠杆菌具有裂解作用。

发明内容

本发明的目的在于筛选具有特定的裂菌作用的基因，通过构建原核表达系统，筛选到具有裂解活性的重组表达产物，确定影响表达产物活性的最优裂解条件，提供一种能够裂解多种血清型大肠杆菌的裂菌制剂及其裂解方法、用途。

本发明的目的是通过以下的技术方案实现的：

本发明涉及一种高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂，所述裂菌制剂是通过如下方法制备而得的：

步骤一，通过噬菌体诱导的方法，诱导大肠杆菌溶原菌株，获得裂解性噬菌体颗粒，纯化得到噬菌体，提取噬菌体的DNA；

步骤二，设计引物，以步骤一所得DNA为模板，应用PCR扩增相应的基因片段；

步骤三，采用原核表达系统pET-28a（+），将步骤二扩增所得DNA构建重组质粒；

步骤四，将步骤三的重组质粒转化到表达菌BL21（DE3），筛选阳性转化子进行蛋白的诱导表达和鉴定，获得重组蛋白；

步骤五，纯化诱导表达的重组蛋白，筛选具有裂解活性的重组表达蛋白，得到蛋白制剂，即高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂。

优选地，步骤二中所述引物的核苷酸序列为，上游：CGCGGATCCATGAGCAGGAAACTCCG，下游：CCCAAGCTTTTATCTGTCGATTCCCC。

优选地，步骤二中所述扩增基因片段为534bp。

优选地，步骤四中获得的重组蛋白为23kDa。

优选地，步骤五中所述筛选具有裂解活性的重组表达蛋白具体为：将获得的纯化的重组蛋白、阳性转化子的细菌裂解液进行平板裂解实验，比较裂菌效果，从而筛选具有裂解活性的重组表达蛋白。

本发明还涉及一种前述的高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂的裂解方法，所述裂解方法采用的还原剂为质量百分比浓度为0.8%的β-巯基乙醇或10mM的半胱氨酸，缓冲液为20mM pH5.2醋酸钠缓冲液，裂解菌液的pH值为8.0，反应温度为37℃。

本发明还涉及一种前述的高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂的用途，所述裂解制剂用作裂解不同血清型大肠杆菌菌株的裂解制剂。

优选地，所述血清型大肠杆菌菌株为大肠杆菌O46、O118、O138、O157和MC1061菌株。