[发明专利]一种抑制结核分枝杆菌的化合物、其筛选方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法、采用所述筛选方法筛选所得抑制结核分枝杆菌的化合物以及该化合物的用途。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的传染性疾病。根据世界卫生组织统计，全世界约有1/3人口感染结核菌，每年约有880万新发病例，200万人因结核病而死亡。目前结核病治疗药物需长期使用，对人体的伤害很大，而且感染菌可在宿主的干酪化的病灶中长期潜伏而成为休眠菌，一旦防御免疫机能低下即可“死灰复燃”而重新发病。目前多重耐药结核分枝杆菌的出现及结核菌在患者体内的“持留”状态，已经成为结核病预防和治疗过程中的重大问题。因此，寻找新的药物作用靶点，建立新的药物筛选模型，研制出能控制多重耐药性结核杆菌和根除休眠菌的强力低毒抗结核药物非常关键。

目前寻找新型抗结核药物的方法大多限于药敏试验，但是结核分枝杆菌由于生长速度缓慢，一次药敏试验周期长达3-4周，不适于大规模筛选，也难发现新型药物。

传统抗结核药物通过抑制细胞壁合成或细菌生长来杀灭MTB，但同时会产生MTB选择性压力。靶向分泌型毒力因子的药物有效解决了这个问题，也避免了药物通过细胞壁时产生渗透性障碍。对于免疫系统受到损害的患者(如HIV感染者)及高风险感染TB的医务工作者,这些药物也能降低感染几率。此类抑制剂与传统的抗生素联用还可以有效清除感染,减少MTB抗性产生。mPTPA/mPTPB是MTB的分泌型毒力因子，以mPTPA/mPTPB为药物靶标筛选出很多有应用前景的抑制剂,预示着未来TB治疗的可选择性。目前很多mPTPA/mPTPB的抑制剂有进一步发展的潜力。新发现的有双位点活性的isoxazole-salicylate化合物具有细胞活性，在感染MTB的巨噬细胞内证明了其治疗效应。与对照相比，消减了巨噬细胞内MTB90%的生长。其独特双位点结合抑制模型是其较高活性及选择性的结构基础，这种结构也为以后设计新抑制剂提供了思路。但是，更多的抑制剂由于缺乏晶体结构信息，阻碍了它们的进一步优化。作为判断治疗药物的标准，对抑制剂与靶标结合复合物进行晶体结构研究及动物模式实验是目前急需的。

酪氨酸磷酸酶能特异地水解蛋白质底物上的酪氨酸磷酸酯键，脱去磷酸，从而调节该蛋白质功能的酶。蛋白酪氨酸残基的磷酸化作用对于调节生理应答过程起着重要作用，例如细胞增殖和分化、细胞迁移、免疫细胞活化和凋亡等。因此，如果细胞中的酪氨酸磷酸化作用失调会引起严重的后果，包括可能会引起自体免疫、非正常代谢应答和细胞转化等，随之而来的是许多疾病的产生，包括：癌症，糖尿病和自身免疫缺陷。有报道PTPB特异性抑制剂有望提高胰岛素的敏感性，有效地治疗2型糖尿病、胰岛素抵抗和肥胖症。这就提示我们，酪氨酸酶抑制剂可能在治疗诱因是mPTPB引起的疾病方面也有显著效果，包括：糖尿病、肥胖、高脂血、高甘油三酯血、高胆固醇血、低HDL水平、动脉粥样硬化、血管再狭窄、炎性肠病、胰腺炎、脂肪细胞肿瘤、脂肪细胞癌、脂肉瘤、血脂异常、肿瘤、癌症，自身免疫疾病等。

结核病作为全球性的公共健康问题，通过借鉴抗癌药物研究成果及研究思路，结合癌细胞中蛋白磷酸酶的信号机制及抑制剂筛选的方法，有助于加速新的抗结核药物面市。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法；同时本发明还提供了采用所述筛选方法筛选得到的抑制结核分枝杆菌的化合物，以及所述化合物的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法，包括以下步骤：

（1）建立以酪氨酸磷酸酶为靶点的筛选模型：以结核菌H37Rv株基因组DNA为模板，PCR克隆酪氨酸磷酸酶基因，转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酪氨酸磷酸酶，进行酶活分析，建立以酪氨酸磷酸酶为靶点的筛选模型；

（2）利用步骤（1）所建立的筛选模型筛选对酪氨酸磷酸酶具有抑制活性的化合物。

作为本发明所述抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法的优选实施方式，所述步骤（1）中采用的宿主细胞为大肠杆菌，用表达载体的目的片段经双酶切，与pET-28a(+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达，获得重组酪氨酸磷酸酶。

作为本发明所述抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法的优选实施方式，所述的IPTG终浓度为0.1～0.2mM，诱导温度为18～37℃。