[发明专利]哈茨木霉T28抑菌成分防治致病疫霉菌制剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种防治致病疫霉菌生物制剂的制备方法，尤其是涉及一种哈茨木霉T28抑菌成分防治致病疫霉菌制剂的制备方法。

背景技术

目前，致病疫霉（Phytophthora infestans Montagne de Bary）是活体营养型的致病卵菌，在Ainsworth（1973）真菌分类系统中隶属真菌界（Kingdom Fungi）、真菌门（Eumycophyta）鞭毛菌亚门（Mastigomycotina）、卵菌纲（Oomycetes）、霜霉目（Peronosporales）、腐霉科（Pythiaceae）、疫霉属（Phytophthora）真菌。在现代生物分类系统中隶属假菌界（Kingdom Chromista）、卵菌门（Oomycota）、卵菌纲、霜霉目、腐霉科、疫霉属。马铃薯是世界第四大粮食作物，也是中国的重要粮、菜、色、饲和工业兼用原料。由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病是马铃薯的一种毁灭性病害，中国从20世纪80年代起，晚疫病的流行频率和流行程度逐渐加重，成为马铃薯生产的1个重要障碍。黑龙江许多马铃薯产区是全国的种薯基地，雨季集中在7、8月，正值马铃薯的结薯期；晚疫病一旦流行，减产很严重并且造成种薯带菌率高，成为用种地区晚疫病流行的重要原因。目前马铃薯晚疫病的防治极大程度上还是依赖于化学防治，这虽然给马铃薯生产带来了很高的效益，但是，环境污染、生态系统自然平衡的破坏等诸多弊端也随之而来。因此，寻找高效的生物防治菌株刻不容缓。

哈茨木霉（Trichoderma harzianum）属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetidae)，丝孢目(Hyphomycetales)，木霉属（Trichoderma）。目前，国内针对哈茨木霉进行生物防治的研究比较多的集中于拮抗作用、抑菌成分、抑菌机理等方面。对于哈茨木霉抑菌活性成分防治致病疫霉菌制剂的制备方法，经检索未发现与本发明相关的报道。

哈茨木霉菌株T28抑菌活性成分制剂对致病疫霉菌室内生长抑制率接近70%，孢子囊萌发抑制率超过70%，游动孢子释放抑制率超过75%。采用该制剂浸种后播种、生长季节喷施制剂，可有效控制马铃薯晚疫病发生，同时可显著提高马铃薯产量。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术中存在的不足之处，提供一种哈茨木霉T28抑菌成分防治致病疫霉菌制剂的制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

哈茨木霉T28发酵液的制备：

（1）采用改良马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基，培养基按比例组成为：马铃薯100g-200g、葡萄糖10g-20g、KH₂PO₄2g-3g、MgSO₄1g-2g、水500ml-1000ml，发酵液pH5.0-6.0，进行液体发酵培养5-10天，接种量为发酵液体积的1%-2%，装液量为锥形瓶容积的35%，发酵培养条件为，温度25℃-30℃，摇床转数125r/min-150r/min；

（2）哈茨木霉T28发酵液中抑菌活性成分提取：将培养5-10天的哈茨木霉菌株T28发酵液用无菌纱布过滤，置于冷冻离心机中，在之后用0.22μm的滤头过滤，将滤液200ml加入800ml95%的分析乙醇浸提3h-5h，水浴加热至50℃，搅拌、加速溶解，将滤液和乙醇的混合溶液浓缩至200ml，加入沸点为60℃的石油醚800ml浸提2h-5h并用分液漏斗分离两部分溶剂，将水层与1000ml乙醚混合，常温下静止放置2h-5h，分液漏斗过滤，将水层与1000ml乙酸乙酯混合，在常温下静止放置2h-5h，分液漏斗过滤，弃水层，将乙酸乙酯层以50℃真空旋转蒸发浓缩，直至液体全部蒸发干，圆底烧瓶底部有黄褐色粉末挂壁；得到抑菌活性成分；

（3）哈茨木霉T28发酵液中抑菌成分制剂的制备：将抑菌活性成分用10%吐温80溶液溶解，恢复为原发酵液过滤液体积的1/10。

本发明的优点是：

本发明采用的原料为可再生的菌物资源，来源丰富、价廉，对由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病具有显著的抑制效果，本发明具有高效、低毒、无公害等特点，对防治由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病具有广泛的应用前景。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作进一步详细描述。

实施例1、

哈茨木霉T28发酵液的制备：