[发明专利]一种猪溶素突变体,其制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪溶素，具体地说涉及一种猪溶素突变体，还涉及其制备方法及用途。

背景技术

猪链球菌病是重要的新发传染病，1998年和2005年先后在我国江苏和四川爆发流行，造成200多人感染，50多人死亡，具有较高的病死率和病残率^[1，2]。猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)是猪链球菌病的病原体，其中2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2，SS2)是主要的致病菌。脑膜炎和链球菌样中毒性休克综合征(Streptococcus-like toxin shock syndrome，SLTSS)是猪链球菌感染的主要临床症状。目前猪链球菌感染的致病机制还不十分清楚，且尚未有可用于人预防和治疗的猪链球菌疫苗。

猪溶素(Suilysin，SLY)是2型猪链球菌已知分泌蛋白中最重要的毒力因子，为胆固醇依赖的溶细胞素(Cholesterol-dependent cytolysins，CDC)[Lun，S，Perez-Casal，J，Connor，W，Willson，PJ.Role of suilysin in pathogenesis of Streptococcus suis capsular serotype 2[J].Microb Pathog.2003，(1)34：27-37.]。研究发现SLY在猪链球菌致病过程中有重要作用，其有助于猪链球菌的胞外存活，能刺激宿主细胞分泌炎症因子，其还对多种宿主细胞有细胞毒性。最近的晶体结构显示(Xu，L，Huang，B，et al.Crystal structure of cytotoxin protein suilysin from Streptococcus suis[J].Protein Cell.2010，1(1)：96-105.)，SLY的晶体结构更类似于中链球菌(Streptococcus intermedius)分泌的ILY(intermedily)的晶体结构，后者除需要胆固醇外，还需要人CD59的帮助才能在细胞膜上形成孔。

目前仅有猪链球菌的甲醛灭活疫苗，尚未有猪链球菌的重组蛋白疫苗，而先前的研究发现，猪溶血素具有较好的保护活性，为潜在的疫苗分子(邢红方，彭远义.猪链球菌2型溶血素b细胞表位预测[J].中国动物保健，2010，12(6)：12-15)。但其溶血活性导致的毒性影响了其作为疫苗分子作用的发挥。

发明内容

为了解决猪链球菌疫苗需求，本发明提供了一种猪溶素突变体，该突变体对猪溶素的C端的353位点进行点突变，将原来的脯氨酸突变为丙氨酸，亮氨酸或缬氨酸。本发明的猪溶素C端的353位点脯氨酸突变为亮氨酸的突变体氨基酸序列如序列表中序列1所示，其编码基因如序列表中序列2所示。C端的353位点脯氨酸突变为缬氨酸的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其编码基因如序列表中序列4所示。

本发明还公开了包含上述猪溶素突变体的质粒，质粒可以为原核表达质粒也可以是真核表达质粒。猪溶素C端的353位点脯氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸的突变体质粒分别为pET28a-sly(P353A)、pET28a-sly(P353L)、pET28a-sly(P353V)。本发明还公开了包含上述质粒的表达菌株，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还公开了上述猪溶素突变体的制备方法。

首先是猪溶素突变体质粒的构建。P353位的猪溶素突变体的构建，首先构建含有SLY的质粒，然后以此质粒为模板，通过设计引物，进行PCR扩增。将PCR产物，转化感受态细胞，将形成的菌落通过PCR筛选阳性克隆，并测序鉴定突变体。将经过鉴定的SLY突变体质粒转化到大肠杆菌中，优选BL21(DE3)菌株，挑取阳性单菌落进行接种振荡培养，收集集菌，进行SDS-PAGE电泳分析。将SLY突变体蛋白纯化，具体步骤为集菌后重悬菌体，超声破菌，目的蛋白为包涵体表达，离心弃上清。然后将沉淀经缓冲液重悬后进行裂解。通过亲和层析柱纯化，然后鉴定纯化蛋白的纯度。将纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，转移到硝酸纤维素膜上，然后经过封闭、洗涤后，加入抗SLY免疫血清，优选兔抗SLY免疫血清，经过孵育、洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG室温孵育后，洗涤、显色。

本发明还公开了猪溶素突变体SLY(P353)的用途。