[发明专利]一种检测喹噁啉-2-羧酸的检测试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测喹噁啉-2-羧酸的检测试剂盒及其方法。

背景技术

卡巴氧作为抗菌促生长剂，广泛应用于畜禽养殖，能促进动物生长、提高饲料转化率、预防和控制猪痢疾和细菌性肠炎。代谢研究和毒理学研究表明，卡巴氧在猪体内迅速转化成脱一氧和脱二氧化合物，其原形和脱氧化合物对人和动物有一定的毒性作用，主要表现为诱癌性、致突变作用、繁殖毒性。因此，1999年欧盟禁止卡巴氧在食品动物中应用，2001年加拿大也颁布法令禁止卡巴氧在市面上销售，2003年食品添加剂联合专家委员会（JECFA）对卡巴氧进行了再评价，委员会决定对卡巴氧撤销其最大残留限量(MRLs)，该残留限量由JECFA于1999年规定，肌肉和肝脏分别为5和30μg/kg。喹噁啉-2-羧酸是卡巴氧在猪体内最稳定的代谢产物，被欧盟法定为卡巴氧在猪食用组织中的残留标识物。目前在动物性食品中喹噁啉-2-羧酸的分析检测方法有很多,包括高效液相色谱法（HPLC）、液质连用(LC-MS)、气质连用(GC-MS)和ELISA。仪器检测主要存在仪器购置费用昂贵、样品前处理复杂、程序繁琐费时、检测费用高、不能现场操作等缺陷，所以在生产中应用受到限制。

而时间分辨荧光免疫分析法（TR-FIA）由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对喹噁啉-2-羧酸残留检测的时间分辨荧光免疫分析法的专利和文献报道。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种动物可食性组织中喹噁啉-2-羧酸残留的检测喹噁啉-2-羧酸的检测试剂盒。

本发明的目的之二在于提供一种动物可食性组织中喹噁啉-2-羧酸残留的时间的分辨荧光免疫检测用方法。

本发明目的之一是这样实现的：一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其关键在于由多孔包被板，缓冲液，喹噁啉-2-羧酸标准，喹噁啉-2-羧酸的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。

本发明目的之二是这样实现的：一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其关键在于：

（1）将喹噁啉-2-羧酸与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原；

（2）将喹噁啉-2-羧酸与卵清蛋白偶联，得到包被原；

（3）用步骤（1）的免疫原免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗QCA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

（4）以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗QCA的单克隆抗体IgG；

（5）用步骤（2）的包被原包被固相载体；

（6）将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；

（7）将步骤（6）的待检物进行测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。

上述的固相载体是多孔包被板，采用48或者96孔的多微孔包被板作为固相载体。

上述的衍生试剂是丁胺。

上述的催化剂剂是腈基磷酸二乙酯。

上述步骤（6）和（7）具体为取包被有QCA-OVA的微孔包被板，加入50μl的QCA-ABA或处理好的样品到各自的微孔中，加50μl以缓冲液稀释的喹噁啉-2-羧酸抗体，25℃~37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液稀释的100μl Eu³⁺-羊抗鼠抗体，25℃~37℃振荡0.5~1小时，用洗涤液洗六次，加200μl增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。

本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析方法来检测喹噁啉-2-羧酸。采用时间分辨荧光免疫的技术主要有两个方面：第一，特异性单抗隆抗体制备，用偶联的免疫原免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗QCA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗QCA的单克隆抗体IgG。第二，Eu³⁺标记抗体的制备。