[发明专利]用于造纸废水生物处理的漆酶、编码基因及其表达与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及了一种用于造纸废水生物处理的漆酶、编码基因及其在造纸废水生物处理中的应用。

背景技术

我国造纸工业年废水排放量大，处理难度高，加上《制浆造纸工业水污染物排放标准》（GB3544-2008）的颁布和实施，造纸工业废水的处理难度加大，处理费用大幅增加。随着人们环保意识的增强，法律法规的不断健全及造纸废水的排放指标的不断严格，造纸废水的处理和达标具有重要的现实意义。

目前造纸废水常用的处理方法主要有物理法和化学法，但无法彻底消除废水中较难处理的物质，如纤维素、半纤维素、木质素和酚类化合物等。生物法是处理造纸废水的一种最有效、最安全和最彻底的方法。

漆酶是一种结合多个铜原子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶。漆酶作用底物相当广泛，能够对多种污染物如各种酚类染料、取代酚、氯酚、硫酚、双酚、芳香胺等。在漆酶介体( HBT、ABTS等)存在下，漆酶还可以催化降解与木质素相关的二苯基甲烷及二噁英等。

漆酶是近年发现在造纸工业中最具潜力的生物酶，具有催化氧化木素的能力。漆酶能选择性地催化木质素降解，不会产生有毒物质，并且生产在常温、常压的温和条件下进行，节约设备和能耗。因此漆酶在造纸工业废水处理等方面有着非常巨大的应用前景。

从1983 年起人们陆续在生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)、交替单胞菌( Alteromonas sp．MMB-1)、大肠杆菌( Escherichia coli )、假单胞菌(Pseudomonas sp． KU03 )、黏质沙雷氏菌( Serratia marcescens)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、极端耐碱芽孢杆菌(B． halodurans)和暗蓝链霉菌( Streptomyces cyaneus )、天蓝色链霉菌( S．coelicolor)及沙链霉菌( S．psammoticus)等一些菌株中均发现有漆酶活性。（汪春蕾等，2011）

由于缺乏再现环境条件的方法和培养基质，造成了绝大多数微生物难以被标准实验室的方法复苏和培养, 称为未培养微生物(uncultured microorganism)。使用标准微生物学培养技术对不同生境微生物可培养性的测定来看，海水中微生物可培养的约为0.001%～0.1%，淡水约为0.25%，土壤约为0.3%，活性污泥为1%～15%左右。也就是说，目前绝大部分自然环境微生物很难或不能通过传统纯培养分离方法得到其纯培养。

因此，利用构建基因文库的分子生物学方法来筛选新的高效漆酶基因，利用毕赤酵母组成型表达来提高漆酶的表达活力，对于促进漆酶在造纸废水生物处理中的应用具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种从造纸污水处理厂的活性污泥中筛选出的新的漆酶基因，该基因能够在酵母细胞中组成型表达。含有新的漆酶基因的酵母表达菌可在造纸废水中繁殖并表达漆酶，从而对造纸废水进行生物增效处理。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种用于处理造纸废水的漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，共544个氨基酸。具体的，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，全长为1662bp，GC含量为40.07%。

本发明涉及的漆酶基因，是一种新的基因，与同类基因没有同源性。其编码的漆酶是一种新的漆酶，与其他已报道的漆酶氨基酸序列相比，相似性小于40%。应当指出的是，对本发明的漆酶基因所编码的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物均属于本发明的保护范围。在已知本发明漆酶基因的情况下，本发明普通技术人员可按本领域常规方法构建载体、转化、表达，获得所述漆酶。

本发明还涉及含有所述漆酶基因的宿主菌。

本发明还涉及含有所述基因的重组载体，将含有所述基因的重组载体转化至宿主菌（通常为酵母菌）中，进行表达，即可获得本发明漆酶。

本发明还涉及所述基因在制备重组漆酶中的应用。

本发明还涉及所述的漆酶在造纸废水生物处理中的应用，本发明的漆酶的最适温度是30-40℃，最适pH为5-6。将基因工程菌进行扩大培养后，按0.05%的添加量添加到曝气池中进行处理。

本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：

本发明提供了一种新的漆酶基因，能够在酵母菌中组成型高效表达，克服了传统纯培养技术及诱导表达的不足，可提高漆酶的表达活力，对于促进漆酶在造纸废水生物处理中的应用具有重要意义。