[发明专利]一种重组人胱抑素C编码基因与表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种重组人胱抑素C编码基因与表达方法。

背景技术

胱抑素C (cystatin C, Cys C)即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白，1983年Anastasi等首次在鸡蛋清中分离纯化得到高纯度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cysteine proteinase inhibitor，CPI）后被命名为胱抑素C，也被称为γ-微量蛋白及γ-后球蛋白，广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中，是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，分子量为13.3KD，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液，因此，其血中浓度由肾小球滤过决定，而不依赖任何外来因素，是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物，可作为肾小球滤过功能指标，较目前常用的肾功能检测项目有更高的灵敏度和特异性，其血清浓度测定是替代传统的血尿素、肌酐(Cr)和内生肌酐清除率(Ccr)测定的首选肾功能评价指标。

由于Cys C及其抗体的来源受限，现有检测Cys C的试剂盒价格昂贵，妨碍了其在国内推广应用。目前，通常采用PCR技术调取Cys C编码基因，克隆后进行重组表达，但表达效率极低，难以满足市场需要。为此我们重新设计了Cys C的编码基因，建立了重组Cys C蛋白的制备体系，以期解决Cys C的来源问题，为CysC检测试剂盒的研发奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组人胱抑素C编码基因与表达方法。

本发明所采取的技术方案为：

一种重组人胱抑素C编码基因，其核苷酸序列如下：

5’-atgcgtggttctcatcatcaccatcaccacgctggtatcgaaggtcgttcctctccaggtaaaccgccacgtctggttggcggtccaatgg

atgcatccgtggaagaggaaggcgttcgtcgtgcactggactttgctgttggcgagtacaacaaagcgtccaatgacatgtatcactctcgtgctctgcaagtggttcgcgcacgcaagcagatcgtagcaggtgtgaactactttctggacgtagagctgggtcgcaccacttgcaccaaaacccagccgaatctggacaactgtccgttccatgaccaaccgcacctgaaacgcaaggcgttctgctcctttcagatctatgctgtaccatggcaaggcaccatgactctgtccaagtctacctgtcaggatgcgtaa-3’ （SEQ ID NO：1）。

重组人胱抑素C蛋白的表达方法，包括如下步骤：

1)  将权利要求1所述的重组人胱抑素C编码基因（目的基因）插入到原核表达载体的多克隆位点，构建重组表达质粒，将重组表达质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌，筛选出阳性克隆菌，得工程菌；

2)  工程菌经发酵、诱导、分离、纯化，得重组人胱抑素C蛋白。

优选的，步骤2）工程菌经发酵培养、IPTG诱导表达融合蛋白、收集菌体，破碎菌体，收集上清液，上清液经镍层析柱纯化，得重组人胱抑素C蛋白。

优选的，IPTG诱导表达融合蛋白的方法：待发酵培养的菌液OD_600nm在0.6～1.0，加入终浓度0.1～10  mmol/L的IPTG，30～40℃培养2～10 h。

优选的，重组人胱抑素C蛋白的表达方法包括如下步骤：

1)  将目的基因的两端加入酶切位点，进行全序列合成，得合成基因序列；

2)  将合成基因序列克隆于T载体，测序确定成功构建重组T载体；

3)  将目的基因从重组T载体上切下，插入到原核表达载体的多克隆位点，构建重组表达质粒，将重组表达质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌，筛选出阳性克隆菌，得工程菌；

4)  工程菌经发酵、诱导、分离、纯化，得重组人胱抑素C蛋白。

优选的，目的基因两端加入的酶切位点不相同。加上不同酶切位点要求在目的基因中不存在，同时是为了便与与载体相连，且使酶切的载体不会发生自身连接。

优选的，目的基因的序列内部不含有其两端加入的酶切位点。

优选的，目的基因两端加入的酶切位点与原核表达载体多克隆位点有相同的酶切位点，且酶切顺序一致。