[发明专利]一种来源于新疆沙冬青的磷脂酶Dα1的基因序列及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于新疆沙冬青的磷脂酶Dα1的基因及其对应编码的氨基酸，此外本发明也涉及到该基因的克隆方法。

背景技术

新疆沙冬青新疆沙冬青(Ammopiptanthus nanus Chengf.)又名矮沙冬青、小沙冬青、矮黄花木，属于豆科(Leguminosae)、黄华族(Thermopsideae)、沙冬青属(Ammopiptanthus Cheng f.)，为第三纪孑遗植物，被列为国家一级保护植物。主要分布在海拔1800～2800m的干旱荒山和石质戈壁类型的内蒙古西部和宁夏、甘肃、新疆的部分沙漠、荒漠地带，是该区唯一的常绿阔叶灌木，分布区内气候干旱，降水量远小于蒸发量，年平均气温6.8℃，气温变化极值可达70℃以上。沙冬青具有很强的抗逆性，在相对瘠薄的土壤条件下仍能在高达70℃左右的地表沙温和低至零下20℃～30℃的环境中正常生长发育。有很强的抗寒、抗旱和耐盐碱等抗逆特性。国内外关于沙冬青属植物的报道包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱机理及相关的超微结构；染色体数目及核型、减数分裂期染色体行为、开花物候、和引种栽培试验等。这些研究都证实了沙冬青抗旱耐冻的特性，因此它是珍贵的抗旱耐冻遗传资源。

磷脂酶D在维管束运输、质膜降解和胞间信号传递等多种过程中发挥作用。磷脂酶D不仅受到Ca²⁺、PIP2和自由脂肪酸的调控，同时在植物中也与异源三聚体的G蛋白、微管蛋白、肌动蛋白、蛋白酶和磷酸酶发生互作。具有多个调控结构域和分子互作机制的磷脂酶D，其活性在细胞中是严格控制的。磷脂酶D在底物偏向性、亚细胞分布和空间瞬时基因的表达上的不同，使其能应对多种刺激，包括：冷、机械损伤、植物病害、脱水和高盐胁迫。磷脂酶Dα1存在于胞质和质膜上，并且在这两者中相对分布的改变反应了外交界的生长压力和生长阶段。磷脂酶Dα1的表达能快速诱导气孔关闭以减少水分散失。

新疆沙冬青作为优秀的抗逆植物，克隆以上抗逆基因对基础和应用研究具有重要意义。

发明内容

本发明的主要目的就是针对荒漠抗逆植物新疆沙冬青的抗逆基因开发研究的局限性，提供一种来源于植物新疆沙冬青的磷脂酶Dα1的基因序列，以期应用于其它转基因作物中使之具有相应的优良的抗逆性能。

本发明的另一个目的是提供一种上述基因序列的克隆方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种来源于新疆沙冬青的磷脂酶Dα1的基因序列，该序列具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列以及克隆该基因对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

上述核苷酸序列，可通过包括下述步骤的方法，从植物新疆沙冬青叶片中提取总RNA、设计引物、进行PCR扩增、测序等克隆得到：

(1)总RNA的提取和纯化：

可采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物新疆沙冬青叶片中提取得到纯化的新疆沙冬青叶片总RNA；常用的RNA提取方法很多，如试剂盒法、热硼酸法、异硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸钠法、十六烷基三甲基溴化铵法、及各种改进方法等，均可用于新疆沙冬青叶片总RNA的提取；本发明中可优选试剂盒法(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNA_OUT2.0提取试剂盒，CAT#90404-50)，进行新疆沙冬青叶片总RNA提取。

纯化主要是为了去除总RNA中的DNA污染，获得纯化的新疆沙冬青叶片总RNA，以满足后续对目的基因的表达进行定量检测等需要。常用的RNA纯化方法包括：DNA酶消化法(简称D法)、酸酚变性法(简称S法)、EDTA法(简称E法)等；本发明中可优选DNA酶(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNA_OUT2.0提取试剂盒，CAT#90404-50)消化法。

(2)中间片段的克隆：

A、中间片段cDNA第一链的合成

以上述步骤(1)纯化的新疆沙冬青叶片总RNA作为模板，使用TaKaRa公司3′-Full RACE Core Set Vet.2.0(Code：D314)试剂盒中3′RACE Adaptor进行反转录，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板；

B、PCR扩增

以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述兼并上游引物(jf2)和兼并下游引物(j×2)，进行PCR扩增。

磷脂酶Dα1基因中间片段扩增引物：

jf2：5′-GCCCAAARGAGCTTTCACTY-3′，