[发明专利]一种梅花染色体周年性制片方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物染色体制片方法，具体是一种梅花染色体周年性制片方法。

背景技术

梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)是重要的木本花卉，对梅花进行染色体层面的研究，是对其进行基因定位、构建物理图谱的重要前提。然而受限于木本植物，其染色体层面的研究极其局限。

现有文献记载，梅的染色体数目据国外Okabe(1927，1929)报道是2n＝16、24，Oginuma等(1987，1989)发表是2n＝16。在国内，主要是黄哲(1989)首次对梅花的染色体进行了研究，黄燕文、包满珠等(1995)对野梅、果梅和花梅染色体的数目及形态进行了研究，林盛华、褚孟嫄(1999)对梅花染色体进行了研究，鉴定梅品种资源的倍数性，为梅分类起源和遗传育种提供细胞学依据。他们所采用的试验材料主要是花后新芽及冬季休眠枝条水培萌发的新芽，取材周期短，时间受限。

染色体显带、荧光原位杂交等技术需要大量的重复实验对结论进行验证，而使用传统的茎尖材料进行染色体制片，取材方便，分裂相丰富，虽然能够满足染色体计数及常规核型分析的需要，但若需要进行大量重复实验，传统的取材方法无法对材料进行长期保存，无法满足大量重复实验的要求，因而严重阻碍了梅花染色体的深入研究。

发明内容

为了解决梅花染色体研究过程中染色体制片取材周期短、时间受限的问题，本发明提供一种梅花染色体周年性制片方法。

本发明所述梅花染色体周年性制片方法，根据时间选取如下分生组织作为制片材料：

1)春季，梅花早春枝条新发茎尖；2)初夏，梅花未成熟胚，以及梅花未成熟胚组织培养所得生长点；3)夏、秋，梅花一年生实生苗顶端生长点；4)冬季，梅花休眠枝条水培所得茎尖。

其中，所述的梅花早春枝条新发茎尖，为梅花叶芽正常萌动伸长时，剥去鳞片及大叶，所取得的萌发茎尖。

其中，所述的梅花未成熟胚，为授粉后25～35天，用石锤除去梅花果实的果肉，打开果核取出种子，所取的未成熟胚。

其中，所述的梅花未成熟胚组织培养所得生长点，为以6-BA浓度是1mg/L、IBA浓度是0.2mg/L的MS培养基进行梅花组织培养，暗培养一周，胚伸长时，切取的0.5cm伸长部位作为梅花未成熟胚组织培养所得生长点。

其中，所述的梅花一年生实生苗顶端生长点，为于第一年8月初对梅花种子进行2℃低温沙藏，55-65天后梅花种子发芽，播种栽培于温室，次年4月中旬移栽至大田，同时对梅花一年生实生苗进行修剪，待分枝后，于上午切取一年生枝条顶端生长点作为梅花一年生实生苗顶端生长点。

其中，切取梅花一年生枝条顶端生长点的时间为上午9:00～11:00。

其中，所述的梅花休眠枝条水培所得茎尖，为于11月中旬取一年生枝条蜡封处理，4℃低温保存一个月后水培，一周后发芽，所取的萌发茎尖。

本发明所述的梅花染色体周年性制片方法，包含以下步骤：

(1)所取制片材料用卡诺固定液低温4℃固定20h以上，作为固定后的材料待用；

(2)配制纤维素酶和果胶酶的酶溶液，纤维素酶的重量百分含量为2.0～2.5％，果胶酶的重量百分含量为2.0～2.5％；

(3)将步骤(1)中固定后的材料用纤维素酶和果胶酶的酶溶液常温酶解，酶解时间长度90～150min，作为酶解后的材料待用；

(4)将酶解后的材料进行压片法制片。

其中，步骤(2)所述配制纤维素酶和果胶酶的酶溶液，纤维素酶的重量百分含量优选2.38％，果胶酶的重量百分含量优选2.38％。

其中，步骤(3)所述用纤维素酶和果胶酶的酶溶液常温酶解，酶解温度优选37℃，酶解时间长度优选110min。

本发明利用梅花不同时期的分生组织进行制片，克服了以往的梅花染色体制片取材受限于冬季及早春的时间限制，实现周年性制片。梅花染色体周年性制片方法克服了传统取材的时间限制，周期长，取材灵活，制片效果良好，有利于梅花染色体深入研究。

附图说明

图1：梅花粉瓣早春枝条新发茎尖染色体100倍油镜镜检图像。

图2：梅花粉瓣未成熟胚染色体100倍油镜镜检图像。

图3：梅花粉瓣未成熟胚组织培养所得生长点染色体100倍油镜镜检图像。

图4：梅花粉瓣一年生实生苗顶端生长点染色体100倍油镜镜检图像。

图5：梅花粉瓣休眠枝条水培所得茎尖染色体100倍油镜镜检图像。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。