[发明专利]一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法及其应用。 

背景技术

安培免疫分析方法将高灵敏度的电化学传感技术与特异性免疫反应结合起来，通过电流变化监测抗原-抗体反应，由于其操作简便、样品需求量少、无需分离、检测范围宽、快速灵敏、结果准确等特点，在社会各个领域的应用越来越广泛。其测量一般包括两个步骤：首先通过一个竞争或夹心式的免疫反应（生物辨识组件，如抗体包被膜）将酶标抗体结合在传感器表面，而后通过一个酶催化反应（如HRP酶对H₂O₂催化）引起测试体系电信号变化并进行测定。安培免疫传感器利用利用抗原、抗体作为分子识别原件，把抗原-抗体特异性反应过程中产生的信号通过换能器转变成电信号，从而对被测物进行定量分析。 

现有的安培免疫传感器的制备过程中，抗体的固定是至关重要的步骤。传统固定法法有物理吸附、化学交联以及溶胶-凝胶包埋等。其中采用物理吸附法固定抗体重复性差，传感器灵敏度低；采用化学交联和溶胶-凝胶包埋不能控制抗体的取向，并且容易造成抗体失去活性，因此现有的安培免疫传感器存在检测速度慢，检测误差大及灵敏度低的缺点。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、准确性和灵敏度高的夹心免疫传感器的制备方法及其应用。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法，包括以下步骤： 

（1）二抗探针的制备

a. Fe₃O₄/Au胶纳米磁珠制备

将100mL 的0.01wt%氯金酸(HAuCl₄）置于烧杯中加热，煮沸后迅速加入2.5mL的1wt%柠檬酸三钠，继续煮沸10min直至溶液变为深红色，轻微搅拌冷却后得到胶体金溶液；将0.2g 的四氧化三铁加入90mL的 50wt%乙醇溶液中超声分散均匀后，加入300uL的3-巯丙基三乙氧基硅烷（3-MPTES）和500uL 氨水，60℃恒温水浴，通N₂保护，反应6h后，用0.1mol/L 盐酸洗6次，每次至少1h，再用乙醇和去离子水分别洗涤3次，得到硅烷化四氧化三铁；将上述的得到胶体金溶液与硅烷化四氧化三铁混合，轻微搅拌至溶液无色透明，外加磁铁磁性分离后，用去离子水水洗，真空干燥后得到Fe₃O₄/Au胶纳米磁珠；

b. 二抗探针Fe₃O₄/Au-HRP-Ab₂的制备

将Fe₃O₄/Au胶纳米磁珠加入水中，超声波震荡，得到1.0mg/mL 的Fe₃O₄/Au纳米悬浮液，将Fe₃O₄/Au纳米悬浮液用0.1M NaCO₃调pH至8.2，加入体积分别为Fe₃O₄/Au纳米悬浮液1/5的1.0mg/mL辣根过氧化物酶(HRP）和10μg/mL 被测物二抗（Ab₂），4℃搅拌24h，外加磁铁磁性分离后，用去离子水水洗3次，再加入与Fe₃O₄/Au纳米悬浮液等体积的pH 7.4含1wt%牛血清蛋白（BSA）的磷酸盐（PBS）缓冲液分散后，得到二抗探针溶液；

（2）电极修饰及抗体结合

a. 电极修饰

采用γ-Al₂O₃抛光的玻碳电极（GCE）作为工作电极，依次在去离子水和乙醇中超声5min，然后将玻碳电极置于0.08mM氯金酸中，在室温，-0.5V的电压下电沉积金15s，用去离子水洗净后，得到Au/GCE电极；

b. 抗体结合

将20μL的0.5 mg/mL被测物一抗（Ab₁）滴至Au/GCE电极表面，4℃温育2h后，将未结合在工作电极表面的被测物一抗用磷酸盐缓冲液轻微冲洗掉，然后将20μL的3wt%牛血清蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）滴至工作电极表面，室温温育1h，封闭非特异性活性位点，将工作电极表面用磷酸盐缓冲液轻微冲洗，洗净剩余的牛血清蛋白，获得牛血清蛋白封闭的Ab1/Au/GCE电极；

 （3）夹心免疫传感器的组装