[发明专利]一种胸水分离肺癌细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤细胞分离的方法，具体涉及一种胸水中分离纯化肺癌细胞的方法，属于肿瘤细胞生物学技术领域。

背景技术

胸腔是由壁层胸膜与脏层胸膜所组成的一个封闭性腔隙，其内为负压，正常情况下两层胸膜之间存在很少量（约1~30毫升）的液体所起润滑作用，减少在呼吸活动过程中两层胸膜之间的摩擦，利于肺在胸腔内舒缩。这种液体从壁层胸膜产生，由脏层胸膜吸收，不断循环之处于动态平衡，液体量保持恒定。当发生某种情况影响到胸膜，无论是壁层胸膜产生胸水或是脏层胸膜吸收胸水的速率有变化，都可使胸腔内液体增多，也就是所谓胸腔积水（积液）。

肺癌胸水是中晚期肺癌患者较常见的并发症，最初可能对生活质量影响还不大，但随着病程进展，会引起呼吸困难、咳嗽、胸痛等症状，对病人的危害甚至超过了肺癌本身。癌性胸水往往是血性的，除脱落的肿瘤细胞外内含大量红白细胞以及细胞碎片。

肿瘤研究需要大量的临床肿瘤组织和细胞，目前大部分研究者主要选用临床肿瘤病人的手术标本，虽然来源较多，标本量大，但由于晚期肺癌的治疗往往以保守治疗为主，不易获得相应的手术标本。

晚期肺癌病人较多出现胸水等并发症，抽取胸水是临床的常规治疗方法，在胸水中分离肿瘤细胞具有简便、经济的特点，同时又可以得到大量的恶性度高病程晚期的肺癌细胞。

以往采用直接离心的方法虽然简单易行，但其它细胞和组织碎片较多，肿瘤细胞的纯度较低，实际应用意义不大。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种胸水分离肺癌细胞的方法，以解决现有技术所存在的诸多不足之处。

本发明的原理：

使用梯度离心的方法可以将不同大小、比重的细胞进行分层和分离，我们在此方法的引导下，经过反复探索和实验，利用肿瘤细胞比其它正常细胞体积大、比重大的特点，建立了一个胸水中分离肺癌细胞的方法，并用于肺癌细胞的收集、培养和细胞系的建立。

Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm/kg H_２O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此用于分离细胞、细菌及病毒。但未见利用相应密度梯度的离心方法在胸水中分离肺癌细胞，同时进行相关的原代培养和建系。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

一种胸水分离肺癌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）不同浓度Percoll溶液的制备: 先用9份Percoll与1份8.5％ NaCl或1.5M PBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液稀释到60~70%wt、40~50%wt；

（2）  胸水悬液的制备：胸水样本1500rpm离心5分钟，弃上清，1% PBS清洗一遍，1500rpm离心5分钟，弃上清，1%PBS重悬；此时胸水悬液中含多种细胞成分以及细胞组织碎片；

（3）不连续密度梯度Percoll层的制备：

60~70%wt、40~50%wt、胸水悬液按照1：1：1的比例由高密度向低密度逐层配置，形成3个密度梯度；

（4）离心：2800-3200rpm离心25-40min；

（5）取样：所要分离的细胞位于两层界面，小心地吸取中间细胞层，1% PBS清洗1遍，1500rpm离心5min，弃上清，收获细胞；以及

（6）细胞培养：获得的细胞用10%FBS 的DMEM常规培养。

其中，步骤（1）中所述的生理溶液为0.85％WT NaCl或0.15M PBS。

所述Percoll溶液的浓度为60%wt、40%wt。

其中，步骤（3）中每个梯度3ml，共9ml，由下至上加入10ml离心管，根据胸水悬液的多少确定多少离心管。

其中，步骤（4）中所述的离心为3000rpm离心30min。

本发明的有益效果：

本发明的方法具有简单、稳定、成本低、效果好的优点。 

附图说明

以下结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明。

图1为细胞分离后的形态图。

图2为细胞分离后的形态图。

图3为细胞分离后的形态图。

图4为细胞分离后的形态图。