[发明专利]生产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组蛋白的方法。具体是应用微生物工程菌生产重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。

背景技术

葡聚糖内切酶(endo-1，4-β-D-glucanase)、葡聚糖外切酶(exo-1，4-β-D-glucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)具有联合水解纤维素的作用。纤维素由葡萄糖分子组成。葡聚糖内切酶(endo-1，4-β-D-glucanase)作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素。葡聚糖外切酶作用于纤维素线状分子末端，依次切下一个纤维二糖分子；β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。即在葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶以及β-葡萄糖苷酶的联合作用下，纤维素水解为葡萄糖分子。葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶广泛应用于饲料、纤维素乙醇，食品、纺织和环卫业等领域，具有巨大的市场潜力。目前葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶产品是来源于天然的产纤维素酶的菌株(细菌、放线菌和丝状真菌)。但是，由于细菌产生的葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶是以包涵体形式存在于胞内，产物难于纯化；而放线菌和丝状真菌生长缓慢，营养要求较高，分泌大量自身的蛋白，难于纯化，生产成本较高。近些年来，陆续有报道表达重组葡聚糖内切酶或葡聚糖外切酶或β-葡萄糖苷酶。由于引用强的启动子，选择生产性能良好的宿主菌和采取基因多拷贝重组的策略，可以较显著地提高重组酶的表达量。但工业上需求的并非葡聚糖内切酶或葡聚糖外切酶或β-葡萄糖苷酶，而是葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的混合酶。当前市面上尚没有重组生产的混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的混合酶产品，若用现有的含葡聚糖内切酶或葡聚糖外切酶或β-葡萄糖苷酶的工程菌生产单酶，然后再将这些酶进行混合应用，其工序复杂，成本高。

枯草芽孢杆菌和毕赤酵母都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化；枯草芽孢杆菌具有兼性厌氧的特性，既能在有要氧的环境进行发酵，也能在无氧的环境进行发酵。

发明内容

本发明构建含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌；用含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌生产重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。

本发明所采用的技术方案是：

1.克隆基因：从木霉基因组中克隆葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶基因。

2.获得构建表达载体的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子序列和抗性基因序列。

3.构建如附图1和附图2的两种表达载体。

4.通过电转化方法将以上构建的含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌、将含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母基因组。筛选高表达葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的重组子作为工程菌。

5.发酵含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和毕赤酵母工程菌生产重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。

本发明构建含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和毕赤酵母工程菌生产重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的优点体现于：

(1)用工程菌取代天然菌株生产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶，通过增加基因拷贝数而提高酶的产量。

(2)用含葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶基因的工程菌取代含单一酶基因的工程菌生产酶，用一个发酵工序同时生产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶取代了用三个工序分别生产重组葡聚糖内切酶或葡聚糖外切酶或β-葡萄糖苷酶。节省了原材料、能耗和人力资源。