[发明专利]一种磷脂酰肌醇的酶解制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种磷脂酰肌醇的酶解制备方法。

背景技术：

单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种重要食源性致病菌。针对LM特有的肌醇磷酸磷脂酶（Cphosphatidylinositol phospholipase C，PI-PLC）和β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)设计显色底物进行快速检测的方法近年来备受关注。PI-PLC酶可以特异性的作用于磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）结构，分解出游离的脂肪烃链，由于大分子脂肪烃链的疏水作用，应用到显色培养基时，在LM菌落周围形成不透明的白色晕圈，从而将LM与其他食源性致病菌及非单增李斯特氏菌区分开来。

目前国内关于PI分离提纯的相关研究较少，主要采用的制备方法局限于利用组分极性差异的溶剂法和色谱柱层析法等。柱层析法分离PI虽然简便有效但是产率较低，重复性差；溶剂抽提法纯化PI消耗大量有机溶剂，成本较高不利于生产应用；另外也有采用高效液相色谱法以及薄层层析法制备的报道，但是由于处理量太少，且成本高难以应用。国内关于PI的制备最近几年只有齐齐哈尔大学以及武汉工程学院做了相关研究，但是由于产率问题都没有得到在LM快速检测方面的应用，因此寻找可行的高效分离手段成为目前亟待解决的问题。

国内LM显色底物制备方面的研究相对落后，直接制约了其在LM检测显色培养基等方面中的应用。随着研究的发展和深入，采用两种以上分离方法相结合的组合方法手段来提高分离纯度，或者酶解法制备PI均具有一定的发展潜力。随着对PI需求的增加，开发一种简便可行的高纯度制备工艺将成为未来研究的发展方向。

传统的PI的制备方法主要利用其组分间极性的差异而分离，有溶剂萃取法、柱色谱法、薄层层析法、高效液相色谱法（HPLC）等。但是仅依靠分离方法很难得到单一磷脂，且溶剂消耗量大，成本较高，难以广泛应用。结合微生物方法，发现常见的四种磷脂酶（磷脂酶A1、A2、C和D）对大豆肌醇磷脂具有特异性作用，其作用位点如式1所示，特别是磷脂酶D可以特异性地水解磷脂酸与碱基(胆碱等)的酯键；并且具有碱基转移特性（transphosphatidylation reaction），即在特定条件下，能催化各种含伯仲位羟基的底物结合到磷脂的碱基上。

式1

磷脂酶已经在磷脂的定向改性、药物的合成等方面得到了有效应用。1987年Nakazato利用混合磷脂在磷脂酶D作用下得到纯度为70%的PI；1989年Rakhimov等在醇和肌醇存在下制备肌醇磷脂；1989年Juneja等报道了在L或D-丝氨酸存在下，将磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）转化为磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS），转化率分别为98.5%和100%，可见采用磷脂酶制备单一磷脂的方法是可行的，但是不同磷脂酶在不同环境下，作用于不同种类的磷脂时，其分解条件均不相同。

发明内容：

本发明的目的是提供一种成本低廉、操作简便、能获取高纯度的磷脂酰肌醇的酶解制备方法。

本发明利用磷脂酶D特异性地水解磷脂酸与碱基(胆碱等)的酯键，并且具有磷脂转移特性（transphosphatidylation reaction），即在特定条件下，能催化各种含伯仲位羟基的底物结合到磷脂的碱基上，而PI却不受影响，利用其对混合磷脂中其它组分的分解，从而提纯高纯度的磷脂酰肌醇，为了实现酶解反应，探索磷脂酶D分解大豆磷脂得到高纯度PI的条件，从而实现了本发明的目的。

本发明的磷脂酰肌醇的酶解制备方法，其特征在于包括以下步骤：

将预处理后大豆磷脂溶于溶剂中，再加入磷脂酶D，磷脂酶D的加入量按50~150unints/100mg预处理后大豆磷脂的量添加，然后在36~40℃，pH值为7.0-9.0，搅拌反应3~12小时，得到酶解产物，酶解产物用正己烷浸提，浸提液浓缩干燥后再用乙醇或乙醇水溶液洗涤并干燥得到磷脂酰肌醇产品；所述的预处理后大豆磷脂是通过以下方法制备的：将大豆磷脂溶于氯仿中，再用甲醇沉淀，收集沉淀物，如此反复若干次，最后得到的沉淀物经干燥后得到预处理后大豆磷脂。

所述的溶剂优选为乙醚。