[发明专利]液相芯片检测水产品中氯霉素的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种液相芯片检测水产品中氯霉素的检测方法。

背景技术

氯霉素(chloramphenicol,CAP)是从委内瑞拉链丝菌中提取制得的一类广谱抗生素，自1948年上市以来,一直是治疗伤寒、副伤寒和沙门氏菌的首选药物,并因其效高价廉,在国内外畜牧业中也广为应用。但是，随着对氯霉素临床应用的深人研究，发现长期微量摄人氯霉素，不仅使沙门氏菌、大肠埃希菌等产生耐药性，还会引起机体正常菌群失调，抑制骨髓机能,导致再生障碍性贫血和其他恶性血液病等相关疾病，严重危害着人类的健康。近年来美国、欧盟、日本等国家都规定禁止氯霉素用于食用动物，而且在出口产品中不得检出氯霉素。

我国农业部2002年《动物性食品中兽药最高残留限量》文件中明文规定该药为禁止用于所有食品的动物兽药，食品中不能检出。但是部分畜禽养殖户盲目追求经济效益、滥用CAP的现象仍然存在。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种可检测水产品中CAP的方法。旨在解决兽药残留检测单一、耗时、成本高等问题，也为进一步同时检测四个兽药残留指标奠定了基础。该方法的建立可满足水产品氯霉素的检测快速、准确的要求，同时，为我国水产品兽药残留的日常监控提供一种新的适用方法。

本发明提供了一种检测水产品中氯霉素的方法，所述方法具体步骤包括以下步骤：

（1）制备氯霉素的人工抗原；

（2）制备氯霉素的单克隆抗体并纯化；

（3）利用步骤（1）得到的人工抗原偶联液相芯片荧光微球；

（4）利用步骤（2）得到的单克隆抗体进行生物素化；

（5）使用步骤（3）得到的偶联的微球以及步骤（4）得到的生物素化的抗体，通过液相芯片法检测水产品中氯霉素残留。

所述的步骤（2）中，氯霉素的单克隆抗体的腹水效价为1:2.56×10⁶。

步骤（5）中，所述的检测水产品中氯霉素残留的步骤依次为：包被好的微球加入处理好的氯霉素样品溶液，随后分别加入偶联有CAP抗原的微球以及生物素化的氯霉素抗体；然后加入稀释好的SA-PE，最后加入终止液，检测荧光强度。

步骤（5）中，包被好的微球一部分加入处理好的氯霉素样品溶液，另一部分加入系列氯霉素标准溶液；标准溶液的浓度包括25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、,3.125ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/mL和0.1ng/mL。

所述的检测荧光强度是通过Luminex 200仪器检测荧光强度值，并用Luminex version2.1软件分析数据。

检测氯霉素的抗体稀释度为：1:3200。

所述的SA-PE的稀释度为1:100。

具体而言，本发明的方法包括如下步骤：

1，制备氯霉素人工抗原；

2，氯霉素单克隆抗体的制备和纯化；

3，氯霉素单克隆抗体的生物素化；

4，制备耦联有氯霉素抗原的液相芯片荧光微球；

5，建立检测水产品中氯霉素的液相芯片法。

步骤1中，所述氯霉素抗原的制备方法具体为：将氯霉素与卵清白蛋白进行偶联，形成人工抗原。

步骤2中，所述的氯霉素单克隆抗体的制备和纯化方法具体为：采用活性酯法将含有梭基的半抗原琥珀氯霉素与载体蛋白(OVA)进行偶联，用重氮化法将含有芳香氨基的半抗原与载体蛋白进行偶联，抗原乳化。免疫小鼠，加强免疫，采集氯霉素抗血清，获得较纯的氯霉素单克隆抗体。