[发明专利]一步法固相合成多肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于药物合成工艺领域。更具体地，本发明涉及一种一步法固相合成多肽的方法。

背景技术

多肽的化学合成目前主要有液相合成和固相合成两种方法。液相合成的优点是每步中间产物的合成可以直接进行过程控制，并有机会得以纯化；缺点是工艺复杂，占用较多工时与人力，需要较多设备与场地。固相合成工艺简单，占用工时与人力较少，物料转移较少而节省设备与场地；其缺点是每步中间产物不可以纯化，必须优化各步反应条件使得转化率接近100％、而且尽可能避免副反应的发生。专利US2978444中描述了一种液相合成增血压素的方法，该工艺路线运用了聚合式合成策略，具有较高的效率，但以下两个问题使得该路线较难获得高纯度产品：在肽片段缩合反应中，肽片段C端氨基酸、特别是His容易消旋；该路线中反复使用了皂化反应，在强碱性水溶液中Asn侧链容易脱酰胺。另外该方法使用了氢化反应，需要特殊设备和工作条件，还要使用较为昂贵的金属催化剂、且容易导致产品中残留重金属问题。更为重要的是，该专利方法无法实现连续合成，需要占用较多生产设备(如反应釜等)与人力、工时。文献Biochemistry 1965，Vol4：2394报道了一种线性合成策略，由于使用了固相合成技术，工艺相对简单，能够保证较高的收率。但该路线使用了氯甲基树脂，最后需要使用氢溴酸将肽链从树脂上解离下来，而且侧链保护基团硝基和苄基在氢化反应中难以完全解离。

多肽药物合成工艺的关键问题之一是对保护氨基酸消旋的控制(中国药物杂2010，Vol 19：102)。专利US6015881对抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋提供了一种通行的解决方案。该方案认为在低温下预先活化氨基酸对抑制消旋十分重要。氨基酸按照以下方式预活化：Fmoc保护氨基酸、HOBt、DIPEA在室温下溶解后冷却到0-5℃，然后将HBTU加入到上述溶液中搅拌至溶解。HBTU最后加料是因为在其不存在时活化和消旋都不会发生。该方案在生产实施过程中需要有一套独立的反应釜A用于配料、控温和活化保护氨基酸，将活化保护氨基酸溶液转移至缩合反应釜B中，以及随后的设备清洁工作。更为重要的是，虽然保护氨基酸的OBt酯稳定性良好，但如果在反应釜A中贮存时间稍长，因不能和氨基缩合而走向消旋通路，故而对预活化时间需要严格的控制(J.Org.Chem.1997，Vol62：4307)。故而预活化方案增加了合成工艺的复杂度。

综上所述，现在还缺乏一种高效合成多肽的方法，因此仍然迫切需要开发新的多肽的生产工艺。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是克服现有的多肽固相合成中为抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋需采用低温预先活化氨基酸，然后将活化保护氨基酸转移至缩合反应釜B中进行缩合反应，该预活化工艺复杂，需要多步骤操作，操作不便，且易造成消旋。为此，本发明对抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋提供了一种通行的解决方案，该方案中配料和保护氨基酸的活化和缩合反应都在同一个反应器内连续进行，无需将保护氨基酸在活化器中低温活化再转移至缩合反应器中进行缩合反应。

本发明的技术方案如下：一种一步法固相合成多肽的方法，其中，合成多肽的所有化学反应在同一个反应器内依次连续完成，无需在活化器中低温活化保护氨基酸再转移至缩合反应器中，在进行任一保护氨基酸的缩合反应时，保护氨基酸、缩合剂先溶解在含有树脂或者肽树脂的反应混合物中，该混合物中含有挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂，然后利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用挥发性有机溶剂的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，然后加入助缩合剂启动缩合反应，缩合反应温度控制在22-28℃。

本发明中，进行缩合反应所用的溶剂由挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成，其中可以是进行缩合反应的常规有机溶剂，较佳的，所述的非挥发性有机溶剂选自DMF和DMSO中的一种或两种；所述的挥发性有机溶剂选自DCM和Et₂O中的一种或两种。利用氮气流将反应原料充分混匀并使挥发性有机溶剂的挥发，从而因挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，然后启动缩合反应。

本发明中，所述的树脂是常规的能够和第一个保护氨基酸进行缩合反应的树脂，优选的羧基树脂，更优选wang树脂或Rink Amide-MBHA树脂。

本发明中，所述的保护氨基酸是常规的氨基上有保护基保护的氨基酸，一般是Fmoc保护氨基酸，或者Boc保护氨基酸，优选Fmoc保护氨基酸。