[发明专利]一种灌流式细胞培养的培养基更换方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种哺乳动物细胞灌流培养方法。

背景技术

随着基因工程的发展，人们逐渐认识到许多生物制品不能在原核细胞内正确表达，它们需要经过真核细胞所特有的翻译后修饰，以及正确的切割、折叠后，才能形成与自然分子一样的功能和抗原性，使得动物细胞一跃成为一种重要的宿主细胞，用以生产各种各样的生物制品，因而，哺乳动物细胞大规模工业化培养成为生物药物生产的关键。目前，动物细胞株培养需要解决的核心问题包括如下三个：如何提高细胞密度，如何长时间维持细胞活力，如何提供高表达所需的营养环境以及良好的物理化学环境。

灌流式培养，又称灌注培养，是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基的细胞培养方式。灌流式培养大致可以解决上述动物细胞株培养的三个问题：连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分，带走代谢副产物，给细胞生长提供优良的环境，细胞密度高，表达时间长，可以大幅度提高生产产率。

实现细胞灌流培养的核心技术是：如何有效地进行细胞截留(将细胞与培养基分离)，即如何在保证细胞密度和细胞活力的基础上更换培养基。目前，有效地解决方法在于使用细胞截流装置。常用的细胞截留装置是沉降截留装置，其中，倾斜式重力沉降器因设备简单、对细胞造成的损伤较小、操作简易，已用于杂交瘤和CHO细胞连续灌注培养(吕中华等，哺乳动物细胞灌注培养工艺研究进展，中国中医药咨讯，2011年7月第3卷第20期)。用倾斜式细胞重力沉降器进行细胞截留，需将细胞悬液从生物反应器中取出，加入沉降器中，细胞悬液进入沉降器以后，大部分活细胞在垂直沉降区沉降，并从底端出料口流出，回流至生物反应器；少量细胞向上流动，留在倾斜沉降区；沉降上清液从上部的排液口排出，工作前沉降器内的空气从排气口排出。

使用截留装置截留细胞，必须要将含有活细胞的培养液抽出，离开原培养环境，且需在沉降装置中停留一段时间，无法到达原位整体分离的目的，存在细胞损伤、反应器环境恶化等问题，且细胞截留装置价格昂贵，生产成本高，难以实现大规模工业化生产。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种灌流式细胞培养的培养基更换方法和灌流式细胞培养方法。

本发明提供了一种灌流式细胞培养的培养基更换方法，它包括如下步骤：

(1)降温：降低细胞培养罐内培养基的温度至4～15℃；

(2)通氧：通入氧气至培养基的溶氧量为150～250％(mg/L)；

(3)更换培养基：停止搅拌，沉降细胞，沉降时间为0～48h，抽出上清液，加入新鲜培养基。

其中，步骤(1)所述温度为8～12℃。

其中，步骤(2)所述溶氧量为250％(mg/L)。

其中，步骤(3)所述沉降时间为15-36h。所述沉降时间进一步优选为20-36h，再进一步优选为20-24h。

其中，所述细胞为哺乳动物细胞。

其中，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞、小鼠骨髓瘤细胞、人胚胎肾细胞、骨髓瘤细胞或者HEK293细胞、BHK细胞。

其中，所述哺乳动物细胞为制备生物制品的细胞。本发明可以提高由动物细胞表达的蛋白或抗体等生物制品的产量，例如单克隆抗体、生长因子和酶、DNA、疫苗等，根据本发明生产的生物制品，具有医药用途，如阿伐他汀(atorvastatin)，卵泡刺激素(Gonal-F)，曲妥株单抗Trastuzumab(Herceptin^TM)，托株单抗注射液Tocilzumab(actemra^TM)，帕利珠单抗Palivizumab(aynagis^TM)，抗CD20抗体(Rituximab)，狄诺赛单抗denosumab(ProliaTM)，卡那奴单抗canakinumab(LlarisTM)，氟替卡松+沙美特罗(salmeterol plus fluticasone)，奥马珠单抗Omalizumab(×olair^TM)，TNFRII-Fc融合蛋白，商品名为(enbrel^TM)，埃索美拉唑(esomeprazole)，缬沙坦(valsartan)等。

本发明还提供了一种用于前述方法的细胞培养罐，所述搅拌式细胞培养罐包括罐体(1)，罐体(1)上设置导流管(3)，导流管(2)上设置开关(7)，罐体(1)内部设置搅拌器(2)，罐体(1)外部设置夹套(4)，夹套(4)通过循环管(5)与温度调节器(6)连接。