[发明专利]一种新型耐高温脂肪酶基因及其编码产物

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型脂肪酶基因及其编码产物，尤其是一种来自红树林土壤微生物的新型脂肪酶基因及其编码产物。 

背景技术

脂肪酶是广泛存在于动植物和微生物中的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放含更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。除此之外，还有多种酶活性，如催化多种酯的水解、合成及外消旋混合物的拆分。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 

自然界中存在的微生物99％是不能培养的，因此从用传统的培养技术分离到的微生物中筛选新的生物催化剂的方法是非常有局限性的。利用免培技术，直接从环境微生物中提取基因组DNA，将其克隆到不同的细菌载体中，构建“metagenome文库”，再从中进行筛选，是前景广阔的筛选方法。 

发明内容

本发明的目的之一在于解决现有技术的不足之处而提供一种能够编码高催化效率、高稳定性和高抗逆性的脂肪酶的基因。 

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种新型耐高温脂肪酶基因，所述脂肪酶基因命名为lip34，所述脂肪酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。 

上述所述的耐高温脂肪酶基因通过以下方法制备所得：从红树林土壤宏基 因组文库中随机挑选4个阳性克隆子，测序，然后运用软件对所得序列进行分析，即可获得所述耐高温脂肪酶基因。 

所述脂肪酶基因lip34通过随机筛选的方法从红树林宏基因组文库中获得，lip34为一个825bp大小的完整脂肪酶基因，利用BLAST在线比对其核苷酸序列进行同源性搜索分析表明，所述耐高温脂肪酶基因lip34与已知基因不存在相似性。 

本发明的另一个目的在于提供一种含有如上所述新型耐高温脂肪酶基因的重组质粒pET32a-lip34，根据脂肪酶基因lip34的序列设计引物，以提取的质粒pUC18-lip34为模板，进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳并回收产物1，凝胶回收产物1经限制性内切酶BamHI与XhoI双酶切并回收产物2，质粒pET32a经BamHI与XhoI双酶切后与回收产物2连接，获得连接产物，即重组质粒pET32a-lip34。 

另外，本发明还提供一种含有上述所述新型耐高温脂肪酶基因的表达载体，采用如下方法构建所得：采用电转法，将上述所得的重组质粒pET32a-lip34转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，将细菌悬浮液恢复培养并稀释涂布于氨苄青霉素抗性培养板上培养，挑取阳性转化子，即得新型耐高温脂肪酶基因的表达载体大肠埃希氏菌BL21-pET32a-lip34。所述大肠埃希氏菌BL21-pET32a-lip34现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏日期为2012年01月16日，保藏编号为CGMCCNo.5736。 

本发明的再一个目的是提供一种耐高温重组脂肪酶的制备方法，包括以下步骤： 

(1)重组质粒pET32a-lip34的构建：根据脂肪酶基因lip34的序列设计引物，以提取的质粒pUC18-lip34为模板，进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳并回收产物1，凝胶回收产物1经限制性内切酶BamHI与XhoI双酶切并回收产物2，质粒pET32a经BamHI与XhoI双酶切后与回收产物2连接，获得连接产物，即重组质粒pET32a-lip34； 

(2)脂肪酶基因lip34表达载体的构建：采用电转法，将重组质粒pET32a-lip34转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，将细菌悬浮液恢复培养并稀释涂布于氨苄青霉素抗性培养板上培养，挑取阳性转化子； 

(3)目的蛋白Lip34的诱导表达：将重组质粒转化的大肠杆菌涂布于含氨苄青霉素抗性的平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单克隆接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，按体积比1∶100的比例转接至新鲜的含氨苄青霉素抗性LB培养基，于37℃、200rpm培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8；加入IPTG诱导培养，培养后经镍柱亲和层析纯化，即得重组脂肪酶Lip34。 

作为本发明一种耐高温重组脂肪酶的制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中的LB液体培养基含有100μg/mL氨卞青霉素。