[发明专利]一种新型耐高温脂肪酶基因及其编码产物

权利要求书

1.一种新型耐高温脂肪酶基因，其特征在于，所述脂肪酶基因命名为lip34，所述脂肪酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

2.一种如权利要求1所述耐高温脂肪酶基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：从红树林土壤宏基因组文库中随机挑选4个阳性克隆子，测序，然后运用软件对所得序列进行分析，即可获得所述耐高温脂肪酶基因。

3.一种含有如权利要求1所述新型耐高温脂肪酶基因的重组质粒pET32a-lip34，根据脂肪酶基因lip34的序列设计引物，以提取的质粒pUC18-lip34为模板，进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳并回收产物1，凝胶回收产物1经限制性内切酶BamHI与XhoI双酶切并回收产物2，质粒pET32a经BamHI与XhoI双酶切后与回收产物2连接，获得连接产物，即重组质粒pET32a-lip34。

4.一种含有如权利要求1所述的新型耐高温脂肪酶基因的表达载体，其特征在于，采用如下方法构建所得：采用电转法，将权利要求3所得的重组质粒pET32a-lip34转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，将细菌悬浮液恢复培养并稀释涂布于氨苄青霉素抗性培养板上培养，挑取阳性转化子，即得耐高温脂肪酶基因的表达载体大肠埃希氏菌BL21-pET32a-lip34。

5.一种耐高温重组脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)重组质粒pET32a-lip34的构建：根据脂肪酶基因lip34的序列设计引物，以提取的质粒pUC18-lip34为模板，进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳并回收产物1，凝胶回收产物1经限制性内切酶BamHI与XhoI双酶切并回收产物2，质粒pET32a经BamHI与XhoI双酶切后与回收产物2连接，获得连接产物，即重组质粒pET32a-lip34；

(2)脂肪酶基因lip34表达载体的构建：采用电转法，将重组质粒pET32a-lip34转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，将细菌悬浮液恢复培养并稀释涂布于氨苄青霉素抗性培养板上培养，挑取阳性转化子；

(3)目的蛋白Lip34的诱导表达：将重组质粒转化的大肠杆菌涂布于含氨苄青霉素抗性的平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单克隆接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，按体积比1∶100的比例转接至新鲜的含氨苄青霉素抗性LB培养基，于37℃、200rpm培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8；加入IPTG诱导培养；培养后经镍柱亲和层析纯化，即得重组脂肪酶Lip34。

6.如权利要求5所述的耐高温重组脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的LB液体培养基含有100μg/mL氨卞青霉素。

7.如权利要求5所述的耐高温重组脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中加入的IPTG的浓度为0.2mmol/L，诱导温度为30℃，诱导时间为5h。

8.如权利要求5所述的耐高温重组脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括步骤(4)：目的蛋白Lip34的检测：取1.5mL诱导后的菌液，12000×g离心1min，弃上清，用50μL50mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)重悬沉淀，加入等体积4×Loading buffer，于沸水中煮10min，13000×g离心10min；取10μL上清液进行SDS-PAGE分析，分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度5％。

9.一种采用如权利要求5所述方法制备得到的耐高温重组脂肪酶Lip34。

10.如权利要求9所述的耐高温重组脂肪酶Lip34，其特征在于，所述Lip34的脂肪酶水解活性为0.34U/mg，Lip34最适温度为85℃，最适pH为11.0。