[发明专利]一种异型双功能连接剂辅助蛋白质的PEG修饰方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质化学领域，涉及一种异型双功能连接剂N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)辅助蛋白质的PEG修饰方法，本发明能够有效抑制蛋白质的PEG二修饰产物和多修饰产物的产生，提高单修饰产物的产率。

背景技术

蛋白质(多肽)类药物在临床诊断、治疗或者作为疫苗预防各种疾病方面发挥着重要作用。但是，多肽及蛋白质类药物存在着溶解性低、稳定性差和半衰期短的缺点。另外，有些多肽及蛋白质类药物具有抗原性和免疫原性，限制了多肽及蛋白质类药物的发展及临床应用。

蛋白质化学修饰技术指蛋白质(多肽)上的活性基团与聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、肝素等修饰剂共价反应，从而提高蛋白质(多肽)药物的溶解性、稳定性和体内半衰期，并减小它们的免疫原性和抗原性等。由于具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性等特点，PEG在蛋白质化学修饰中有着更为广泛的研究和应用。美国FDA也批准了PEG修饰的蛋白质(多肽)药物用于临床使用。

PEG修饰蛋白质(多肽)主要包括氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰等。其中一类是定点修饰，如N末端修饰和半胱氨酸残基修饰。N末端修饰是蛋白质(多肽)N末端的α-氨基通过PEG-醛类修饰剂与还原剂如氰基硼氢化钠进行的还原烷化过程。蛋白质侧链赖氨酸残基的ε-氨基也会与之反应，因此这种修饰反应并不完全是特异性的。半胱氨酸残基修饰利用的是蛋白质分子游离的巯基与PEG(如PEG马来酰亚胺)进行共价连接，这一反应特异性强。但是有的蛋白质缺乏游离的巯基，或者游离的巯基位于蛋白质活性区域附近，PEG修饰后容易出现蛋白质活性的显著降低。

另一类是随机修饰，常利用蛋白质赖氨酸上的ε-氨基进行反应，此方法易于进行PEG修饰，且反应速度快、修饰率高。1990年，FDA首次批准了PEG-腺体苷脱氨酶上市。此后，PEG-天冬酰胺酶、PEG-干扰素α-2b等药物也被被批准上市。这类PEG修饰蛋白质药物所使用的修饰方法就是随机修饰。。但是随机修饰也有其自身的缺点，即往往造成PEG二修饰和多修饰产物的产生，修饰产物比较复杂，对蛋白质的活性影响大，导致生产时批次间的稳定性差，不易满足药物生产的要求。

异型双功能连接剂辅助蛋白质的PEG修饰方法是一种较为新颖的PEG修饰方法，这种方法的原理是异型双功能连接剂可与蛋白质上的氨基共价连接并引入巯基，引入的巯基又可与马来酰亚胺-PEG反应，最终形成蛋白质的PEG修饰产物。Kim D.Vandegriff等人在2003年曾报道过用异型双功能连接剂Traut试剂(2-亚氨基硫烷，简称IT)于人血红蛋白的PEG修饰中。其反应机理如下所示：

本发明中采用另一种异型双功能连接剂N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(简称SATA)以辅助蛋白质的PEG修饰。其反应机理如下所示：

SATA与蛋白质游离氨基的反应是由其一端的琥珀酰亚胺基团完成的。相对于IT的反应，琥珀酰亚胺基团与游离氨基的反应更易进行。同时SATA与蛋白质反应后引入的巯基并不是游离的，须加入羟胺去除保护剂，巯基方可暴露出来。

本发明采用SATA做修饰剂，辅助蛋白质的PEG修饰，所选用的蛋白质是核糖核酸酶A(RNase A)。核糖核酸酶A的分子量为13.7kDa，整条肽链上共有11个赖氨酸残基。当采用氨基的随机修饰时，PEG的多修饰产率过高，不利于生产控制和批次间的稳定性。

发明内容

本发明公开了一种异型双功能连接剂辅助蛋白质的PEG修饰方法，以及利用上述方法抑制蛋白质的PEG二修饰与多修饰产物、分离纯化单修饰产物的工艺和条件。

一种异型双功能连接剂辅助蛋白质的PEG修饰方法，主要步骤为：向待修饰的蛋白质溶液中加入异型双功能连接剂；反应完成后，加入羟胺去除巯基保护剂，使巯基暴露；离心除去未反应的异型双功能连接剂及其它副产物，随后加入PEG修饰剂，完成蛋白质的PEG修饰。

所述异型双功能连接剂一端的基团与蛋白质的氨基反应，实现与蛋白质的共价结合；与蛋白质共价结合后，它的另一端存在一个暴露的巯基。

所述异型双功能连接剂优选N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(N-Succinimidyl S-Acetylthioacetate，简称SATA)

本发明的异型双功能连接剂辅助蛋白质的PEG修饰方法，具体步骤如下：

步骤1，将待修饰的蛋白质按一定浓度溶于pH 7.0～8.0、20mM的磷酸钠缓冲液溶液中；