[发明专利]苏云金芽胞杆菌无芽胞无晶体菌株、其构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及苏云金芽胞杆菌无芽胞无晶体菌株、其构建方法及其应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)，革兰氏阳性菌，芽胞杆菌属，其最明显的特征是在芽胞形成的同时会产生具有杀虫作用的伴胞晶体，其对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目等农林业害虫具有特异性的杀虫活性[Raymond，B.，P.R.Johnston，C.Nielsen-LeRoux，et al.，2010.Bacillus thuringiensis：an impotent pathogen？Trends Microbiol.18(5)：p.189-94]，目前成为国际上应用最广泛最成功的生物农药。商品化的苏云金芽胞杆菌制剂产品一般是杀虫晶体蛋白和芽胞的混合物，大型发酵生产，应用叶面喷洒。但是芽胞对高温、低温、化学试剂、辐射、水解酶等不利条件具有很强的抗逆性[Errington，J.，2003.Regulation of endospore formation in Bacillus subtilis.Nat Rev Microbiol.1(2)：p.117-26]，Bt制剂活芽胞的大量释放可能带来环境生态的潜在危险，所以开发对生态与环境更安全的、新一代灭活的生物农药十分必要。而无芽胞的苏云金芽胞杆菌可以产生晶体，并具有与有芽胞苏云金芽胞杆菌相当的活性，具有一定的应用潜力[Sanchis，V.，M.Gohar，J.Chaufaux，et al.，1999.Development and field performance of a broad-spectrum nonviable asporogenic recombinant strain of Bacillus thuringiensis with greater potency and UV resistance.Appl Environ Microbiol.65(9)：p.4032-9]。

研究发现在芽胞的形成过程中，母细胞中4个全局调控因子σ^E因子、SpoIIID、σ^K因子、GerE先后作用，分别在芽胞不同的发育阶段起作用，控制芽胞形成的一系列基因的转录与调控，其中σ^K因子和σ^K因子是转录起始因子，gerE基因和spoIIID基因类似，其表达产物为小型序列特异性DNA结合蛋白，主要对σ^K因子或σ^E因子控制转录的相关基因起特异性激活或者抑制的转录调控作用[Wang，L.，J.Perpich，A.Driks，et al.，2007.Maintaining the transcription factor SpoIIID level late during sporulation causes spore defects in Bacillus subtilis.J Bacteriol.189(20)：p.7302-9.Eichenberger，P.，M.Fujita，S.T.Jensen，et al.，2004.The program of gene transcription for a single differentiating cell type during sporulation in Bacillus subtilis.PLoS Biol.2(10)：p.e328]。在Bt中σ^K因子对spoIIID基因具有正调控作用，同时SpoIIID蛋白对σ^K因子的表达具有正调控作用，而σ^K因子对σ^E因子的表达具有负调控作用。重要的是spoIIID基因突变体可以产生伴胞晶体，但不产生芽胞[张茜茜，束长龙，张杰，等.2009.苏云金芽胞杆菌spoIIID基因缺失突变株的特点.微生物学报，49(9)：1165-1170]。