[发明专利]基于双层磷脂膜修饰石墨烯的复合纳米材料定量检测磷脂酶的生物传感方法

说明书

技术领域

本发明属于一种定量检测磷脂酶的生物传感方法，具体是指，通过磷脂非共轭自组装在石墨烯表面形成双层磷脂膜包覆的水溶性石墨烯复合纳米材料，再利用磷脂酶水解修饰在石墨烯表面覆盖的磷脂后，从而引发磷脂末端的荧光基团衍生物远离石墨烯产生荧光信号增强。

背景技术

石墨烯是一种由碳原子以sp2杂化轨道组成六角型呈蜂巢晶格的平面薄膜，只有一个碳原子厚度的二维材料，基于其优异的光学、电学性能，近年来被科学家们研究应用于生命科学领域，但是由于石墨烯本身的超疏水结构，其在水溶液中的不溶性大大制约了石墨烯在众多重要生物学方向的应用前景。

磷脂酶是一类重要的跨膜信号转导酶，其催化磷脂水解生成的产物作为重要的脂类信号分子参与脂类新陈代谢，形成复杂的信号转导网络。因此，磷脂酶活性检测对于掌控生物体许多重要生命活动如细胞增殖，细胞信号传导，细胞分化以及炎症、肿瘤疾病等有着不可忽视的重要作用。传统的检测方法有荧光底物法、比色法、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法(MS)，磷同位素31核磁共振法(³¹P NMR spectroscopy)以及电化学方法，这些方法均灵敏度偏低，且需要繁琐的步骤或者昂贵的仪器。

发明内容

本发明旨在针对现有技术存在的不足，提出一种基于双层磷脂膜修饰石墨烯的复合纳米材料定量检测磷脂酶的生物传感方法。

为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：所述基于双层磷脂膜修饰石墨烯的复合纳米材料定量检测磷脂酶的生物传感方法，包括如下步骤：

(1)制备含有末端标记荧光素基团的FL-DHPE的磷脂双层脂质体；

(2)将步骤(1)制备的磷脂双层脂质体与石墨烯在超声下合成为磷脂膜包覆的石墨烯复合纳米材料；

(3)将步骤(2)合成的石墨烯复合纳米材料与待测磷脂酶反应，通过荧光检测途径定量检测磷脂酶活性。

其中，步骤(1)所述的制备含有末端标记荧光素基团的FL-DHPE的磷脂双层脂质体是将乙醇胺末端交联上荧光素基团的荧光磷脂分子FL-DHPE和DPPC通过薄膜分散法制得磷脂双层脂质体。

其中，所述磷脂膜包覆的石墨烯复合纳米材料中，FL-DHPE末端标记的荧光素基团与石墨烯表面的距离为2～3nm。

本发明的生物传感方法中利用磷脂分子自组装形成的脂质体与一定量的石墨烯通过超声步骤，形成双层磷脂膜包覆的石墨烯复合纳米材料，合成方法简易，材料水溶液分散性好、稳定性佳，且在不影响石墨烯这种新型材料优异光学、电学性能的前提下完美解决石墨烯的水溶液分散性问题。在普通磷脂分子中加上一种荧光基团标记磷脂衍生分子，混合自组装在石墨烯表面，借助了石墨烯作为一个宽吸收范围的荧光淬灭剂，其荧光淬灭效率远高于常用的石墨烯替代物-氧化石墨烯，使组装在其表面的荧光磷脂分子与之发生荧光能量转移(FRET)，在磷脂酶活性作用下，包覆在石墨烯表面的磷脂分子被催化水解后磷脂分子末端的荧光基团衍生物离开合成的石墨烯复合纳米材料，产生荧光信号增强，检测过程只需一步，操作简便、反应快速，成本低廉，且灵敏度优于以往所有方法成百上千倍。

以下对本发明做进一步说明：

针对合成双层磷脂膜修饰的石墨烯复合纳米材料，首先利用一种乙醇胺末端交联上荧光素(fluorescein)基团的荧光磷脂分子N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1，2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(FL-DHPE)和普通磷脂分子二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)通过经典的薄膜分散法得到磷脂双层脂质体，再与过量的石墨烯在细胞粉碎仪中以20W功率超声2小时，石墨烯借助其大面积双面芳香环层和已合成的脂质体疏水烷烃夹层通过范德华力和疏水作用力，形成双层磷脂膜包覆的石墨烯。然后，将过量的石墨烯用离心方法去除，上清液即是本文构建的双层磷脂膜修饰的石墨烯纳米复合材料，置于4℃冰箱保存备用。