[发明专利]一种紫薇属植物茎尖染色体制片方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物染色体制片方法，具体涉及紫薇属茎尖染色体制片方法。

背景技术

紫薇属植物(Lagerstroemia)隶属于千屈菜科(Lythraceae)，其主要种如大花紫薇、尾叶紫薇等都是我国夏季重要的观赏花木。与其他园林花卉相比，紫薇属染色体研究要落后很多，且该属植物多为中小染色体，不易染色，经典的细胞学手段难以识别其染色体，从而限制了深入理解紫薇属分子细胞遗传学机制研究的进行。

因紫薇属植物多为非整倍体且染色体较小(Graham and Cavalcanti，2001)，所以此属植物染色体数目报道不统一，Bowden认为紫薇与大花紫薇染色体数目均为2n＝50(Bowden，1945)；Guha却认为其染色体数目仅为2n＝48(Guha，1972).国内几种重要染色体图谱中对紫薇属植物染色体数目记载也各不相同，主要集中在2n＝50或2n＝48.宋平(2009)、童俊(2009)等在紫薇多倍体倍性鉴定时均采用常规压片法，目前尚未有人对紫薇染色体的制片技术进行系统研究。

紫薇属植物由于细胞壁较厚且染色体小而多，使用常规压片法时会因预处理液及解离液的毒害作用而使染色体更加短缩，并且在压片过程中染色体易重叠，不易获得清晰分裂相，难以达到荧光原位杂交实验所需染色体的标准，不利于实验的进行。因此，使用常规压片方法制得的染色体压片只能用于常规观察计数及初步核型分析，无法通过荧光原位杂交进行精确核型分析，迫切需要一种新的染色体制片技术，其制片能够满足荧光原位杂交精确核型分析的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种紫薇属茎尖染色体制片方法，以克服现有技术的不足。

本发明提供一种紫薇属植物(Lagerstroemia)茎尖生长点染色体制片方法，包括以下步骤：

(1)取紫薇属茎尖生长点于固定液中固定；

(2)将固定后的茎尖生长点用蒸馏水洗净转移至前低渗溶液处理；

(3)蒸馏水洗净吸干水分，于混合酶液中酶解；

(4)将酶解后的茎尖生长点用蒸馏水润洗，低渗处理；

(5)将低渗处理后的茎尖置于载玻片，滴加步骤(1)所述的固定液，压碎茎尖，烤干载玻片；再次滴加固定液，再次烤干；冷却后滴加荧光染液染色；滴加荧光封片液。

其中，步骤(1)为选取紫薇属一年生枝条茎尖生长点或初冬修剪经冷藏处理的枝条水培后新发出的茎尖生长点最内侧长度为0.5～1.0cm的茎尖部分。

其中，步骤(1)的取材时间优选为上午9:00～11:00。

其中，步骤(1)固定液其配方为无水乙醇∶冰醋酸∶三氯甲烷体积比为5∶3∶2。

所述冰醋酸、三氯甲烷均为分析纯。

其中，步骤(1)固定时间为18～24h。

其中，步骤(1)固定条件优选为-20℃。

其中，步骤(2)前低渗溶液为0.075mol/L的KCl。

其中，步骤(2)前低渗溶液处理时间为20～30min。

优选地，前低渗溶液处理时间为30min

其中，步骤(3)混合酶液为2.5％纤维素酶∶2.5％的果胶酶∶0.01％蛋白酶K按体积比2∶1∶3配制得到。

其中，步骤(3)酶解条件为37℃水浴酶解4～5h。

其中，步骤(4)低渗处理的时间为20～30min。

优选地，低渗处理时间为30min。

步骤(4)采用双蒸水进行低渗处理。

其中，步骤(5)的第一次烤干载玻片前，是将压碎茎尖后，弃去大块的组织，趁材料未干时加一滴固定液，使剩余组织均匀涂布于载玻片上，酒精灯火焰上微微加热烤干。

其中，步骤(5)所述的荧光染液为2μg/mL DAPI荧光染液，加入量为20μL，染色时间为10min。

其中，步骤(5)中染色后，冲去染液，滴加荧光封片液，得到具有紫薇属茎尖染色体的玻片。

本发明提供了制的具有紫薇属茎尖染色体的玻片。

本发明提供了上述制片方法在紫薇属基因组功能学中的应用。