[发明专利]一种基于表面等离子共振技术的种质资源中特定DNA序列鉴定方法

权利要求书

1.一种应用表面等离子体共振仪的种质资源中特定DNA序列鉴定方法，利用同一传感芯片对特定种质资源或DNA序列进行鉴定；其特征在于包括以下步骤：

（一）传感芯片表面适配体固定：选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入5-50μL浓度为1-50μg/L已标记生物素的免疫球蛋白E适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上免疫球蛋白E适配体；

（二）对特定单链DNA进行免疫球蛋白E标记；

（三）标准溶液配制：用0.01-0.1mol/L（pH＝7.4）的磷酸盐缓冲液配置免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液，浓度为0.1ng/mL至1mg/mL，加入等量特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体充分混合，获得特定单链DNA标准溶液，其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还可以大于加入的适配体量；

（四）建立对照曲线：采用表面等离子共振谱仪测量，以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准，通过微泵通入5-100μL特定单链DNA标准溶液，记录下表面等离子体共振仪光谱图，获得特定单链DNA表面溶液的表面等离子体共振谱图稳定值A；

（五）检测鉴定：提取种质资源总DNA，进行不对称PCR扩增反应，获得单链DNA；对于待测单链DNA样品进行一系列预处理，取待测单链DNA溶液与免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液充分混合后，竞争结合特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还不少于加入的适配体量；采用表面等离子体共振检测仪记录待测单链DNA的光谱图；通过检测免疫球蛋白E，间接鉴定特定DNA是否存在；对比待测单链DNA样品的谱图稳定值B与特定单链DNA的谱图稳定值A，当B小于A时，说明种质资源中含有特定DNA序列，当B等于A时，说明不含有特定DNA序列；

（六）通入0.01-0.05mol/L（pH为2-3）的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，冲洗传感芯片表面，进行传感元件再生，用于其它种质资源中特定DNA序列的鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（二）的标记方法包括DNA的对苯二异硫氰酸酯修饰和与免疫球蛋白E的氨基偶联。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：当种质资源为水稻，标记方法为将水稻一段SSR单链与对苯二异硫氰酸酯反应后，再与免疫球蛋白E的氨基偶联，形成通过对苯二异硫氰酸酯连接的免疫球蛋白E-SSR序列偶联物，待用。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用核酸适配体为识别分子，核酸适配体序列与待测物直接相关。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（一）传感器表面适配体固定，包括如下步骤：

（1）将链霉亲和素SA修饰的传感芯片插入表面等离子体共振检测仪中，在工作通道中进行在线传感表面修饰；

（2）通入0.02mol/L（pH＝7.4）的磷酸盐缓冲液；

（3）通入5-50μL浓度为1-50μg/L生物素修饰的免疫球蛋白E适配体溶液，进行在线偶联至基线稳定；

（4）重复步骤（2）至（3），获得免疫球蛋白E适配体修饰的传感芯片。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用免疫球蛋白E标记待测物，与未标记样品一起与核酸适配体发生特异性竞争识别。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（三）中纳米粒子可以是金属纳米粒子或磁性纳米粒子或高分子化合物。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（四）和（五）中通过检测免疫球蛋白E的含量，间接鉴定特定DNA是否存在，提高表面等离子体传感芯片的可重复利用性，适用于各种种质资源中特定DNA序列的检测。