[发明专利]一种阿嗪霉素B的基因工程菌WSD2CP及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域，更具体涉及一种阿嗪霉素B的基因工程菌WSD2CP，同时还涉及一种阿嗪霉素B的基因工程菌WSD2CP的制备方法，还涉及一种阿嗪霉素B的基因工程菌WSD2CP在发酵生产上的应用。 

背景技术

微生物是许多天然活性产物的重要来源，目前在抗肿瘤、抗真菌、抗细菌、抗寄生虫等方面具有功效的活性物质中有大约70％-80％来源于链霉菌(Berdy，J.，2005.Bioactive microbial metabolites.J.Antibiot.58，1-26)，因此，链霉菌具有较大的商业应用价值。但野生型菌株对这些天然产物的生物合成量通常是达不到工业化发展需求的(Parekh S，Vinci VA，Strobel RJ，2000，Improvement of microbial strains and fermentation process.Appl Microbiol Biotechnol 54：287-30)，这样就需要对链霉菌菌株进行改造，以提高抗生素生物合成产量。 

阿嗪霉素B是一种结构新颖、作用机制独特的抗肿瘤抗生素，其抗肿瘤活性强、选择性高、毒性较低，具有很好的应用前景。但是阿嗪霉素B性质极不稳定性，很难从其产生菌Streptomyces sahachiroi中获得稳定来源的天然产物，这给阿嗪霉素B生物活性的研究和应用带来了一定的困扰。因此，提高阿嗪霉素B的生物合成产量具有十分重要的意义。本发明旨在通过遗传学手段，增强生物合成途径中某些关键基因的表达量，以提高阿嗪霉素B的生物合成量。 

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种阿嗪霉素B的基因工程菌WSD2CP，该菌株与野生型菌株Streptomyces sahachiroi ATCC33158相比，在产生阿嗪霉素B的水平上有了很大提高，大约为野生型的2-3倍。 

本发明的另一个目的是在于提供了一种阿嗪霉素B的基因工程菌WSD2CP的制备方法，方法易行，操作简便，该方法主要是发现了对抗肿瘤抗生素阿嗪霉 素B生物合成产量具有重要影响的基因，并利用组成型强启动子PermE^*替换原始启动子，增强该基因的表达量，从而提高了阿嗪霉素B的产量。 

本发明的另一个目的是在于提供了一种阿嗪霉素B的基因工程菌WSD2CP在发酵生产上的应用，利用固体发酵及萃取技术成功地从基因工程菌WSD2CP中提取到了阿嗪霉素B，其产量与野生型菌株相比有着较大的提高，基因工程菌WSD2CP可以更好地应用于工业发酵。 

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 

通过基因工程手段，首先对阿嗪霉素B生物合成基因簇上可能具有重要功能的基因进行同框缺失，确定它们在该抗生素生物合成途径中的作用。用合适的表达载体进行相应基因缺失菌株的互补实验，验证是单基因缺失而引起的菌株产素变化，发现aziD2基因的缺失会导致菌株完全不产阿嗪霉素B，而互补该基因后菌株恢复产素能力，并在产素水平上要高于野生型，可能是因为在组成型强启动子PermE^*的作用下aziD2基因的表达量增加，进而影响抗生素的生物合成。表达质粒的构建是以含有阿嗪霉素B生物合成基因簇片段的链霉菌基因组文库质粒为模板，进行PCR扩增，得到含有RBS区域的aziD2基因，这个基因已经测序和发表，在GenBank中的蛋白序列为ABY83173.1。将aziD2基因插入到整合型表达载体pMSB-WS052的组成型强启动子PermE^*下游，获得aziD2基因的表达质粒pWS052-D2。然后通过接合转移的方式导入到aziD2基因缺失的菌株。通过生物活性测定和HPLC检测分析的方法，对野生型菌株、aziD2基因缺失菌株、aziD2基因互补菌株进行阿嗪霉素B产量变化的分析，以确定抗生素高产菌株的获得。 

一种阿嗪霉素B的基因工程菌WSD2CP的制备方法，其步骤是： 

1)Streptomyces sahachiroi ATCC33158中aziD2基因缺失突变株的构建。