[发明专利]抗人大肠癌干细胞相关蛋白LYRM2的单克隆抗体及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种抗人大肠癌干细胞相关蛋白LYRM2的单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤细胞株及其制备与应用。

(二)背景技术

LYRM2基因定位于人类第6号染色体的长臂15区，在人类、猩猩、小鼠、犬、鸡、大鼠和斑马鱼中高度保守。这个基因包含4种转录产物，仅仅转录子1能翻译出结构蛋白，其他3种均因缺少翻译起始密码而不能启动翻译过程。LYRM2基因编码88个氨基酸，属于LYR复合体1超家族，这个家族被认为可能参与了真核细胞NADH复合体的组成，具体功能如何尚待研究。在我们的前期研究中，通过全基因组表达谱芯片比较结肠癌肝转移来源CD133+细胞与CD133-细胞，发现LYRM2在CD133+细胞中高表达。CD133作为干细胞一种重要的表面标记，已经在各种实体瘤中被广泛应用。但是关于LYRM2蛋白的结构和功能方面尚未见文献报道。为了进一步研究LYRM2基因及其蛋白在大肠癌干细胞中的作用，获得该蛋白的抗体成为当前的首要任务。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种抗人大肠癌干细胞相关蛋白LYRM2的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其制备与应用。

本发明采用的技术方案是：

一种抗人LYRM2蛋白单克隆抗体，该抗体为IgG1亚类，由保藏号为CCTCC No：C201212的杂交瘤细胞株D0F8分泌产生。

本发明还涉及所述的单克隆抗体的制备方法，所述方法包括：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的人LYRM2基因插入原核表达载体pET-43.1b(+)中，构建重组载体，并将重组载体转化到宿主细菌E.coli.BL21(DE3)中，以含AMP50μg/mL的LB培养基于37℃下培养3h后，筛选宿主菌中高表达的阳性表达菌株作为工程菌，添加终浓度1mmol/L的IPTG于37℃下诱导3h，分离纯化(离心收集菌体，超声破碎后离心取上清经过镍柱进一步纯化)诱导液获得可溶性LYRM2融合蛋白，利用肠激酶酶切纯化即得氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的可溶性LYRM2蛋白；具体方法如下：从肠癌细胞系SW480提取总RNA，用RT-PCR方法得到SEQ ID NO.1所示核酸序列。扩增引物序列为：上游引物为：5′-GATGGCTGCTTCCCGCTT-3′；下游引物为：5′-GGACAGGTACCTTAAGATTTTGCTAAAGCAAG-3′。5′端引入PshA I酶切位点，3′端引入Kpn I酶切位点；

所述原核表达载体为pET-43.1b(+)，整合了一个促溶解多肽Nus Tag序列，可增加LYRM2蛋白的可溶性避免包涵体的形成，同时可以通过该载体自带的His Tag利用Ni-NTA HisBind树脂进行纯化。此外，产物可以通过肠激酶将融合蛋白的Nus Tag部分切除而获得目的蛋白，并不会像非融合蛋白那样在N末端留下多余的氨基酸残基。因此，本发明利用该系统可获得高纯度的可溶性LYRM2蛋白。所述的表达宿主菌E.coli.BL21(DE3)以T7RNA聚合酶为表达系统，可高效表达外源基因蛋白。

SEQ ID NO.1序列如下：

atggctgcttcccgcttacccccagcgacgctaacgttaaagcagttcgtaagaaggcaa 60

caagttcttctcctctacagaaggattttgcaaacaattcggcaagttccaaatgattct  120

gatcgcaaatacctgaaagattgggcaagagaagaattcagaagaaacaaaagtgccacc  180

gaagaggatacaatccggatgatgattactcaaggcaatatgcagctcaaggagttagaa  240

aaaacacttgctttagcaaaatcttaa                               267

SEQ ID NO.2序列如下：

Met Ala Ala Ser Arg Leu Pro Pro Ala Thr Leu Thr Leu Lys Gln

1                 5                  10                 15

Phe Val Arg Arg Gln Gln Val Leu Leu Leu Tyr Arg Arg Ile Leu