[发明专利]对大豆直接进行基因转化的方法

权利要求书

1.一种对大豆进行基因转化的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）挑选饱满、无病斑、完整的大豆种子经氯气灭菌处理5-12h，于22-25℃条件下用无菌水浸泡大豆18-24h；

2）用细针尖（直径0.1-0.2mm）垂直刺入茎尖分生组织处5-10次，深度1-2mm；

3) 取单菌落于2mL含相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃摇床上200r/min振荡培养12-16h，待OD₆₀₀为0.6-0.8时，按1:1000的比例，再于28℃摇床上200r/min培养至对数期，取50mL离心管4000r/min，25℃离心10min收集菌体，用重悬液重悬菌体，加入100μmol/L的乙酰丁香酮，备用；

4）将已处理的大豆种子浸入含乙酰丁香酮(100μmol/L)的农杆菌侵染液中，并辅助真空度为40-60KPa的真空渗透处理15-20min；

5）将侵染后的大豆取出用无菌水清洗2-3遍后用无菌滤纸吸去多余菌液后放入共培养培养基中，25-27℃、2000Lx光照强度下培养2-3天；

6）于育苗盘进行播种。当植株长出第三片复叶时进行草甘膦（350mg/L）涂抹实验，进行抗性检测，用棉签蘸取草甘膦药液擦拭叶片，未涂叶片作为对照，7天后观察植株的抗性反应；

7）获得具草甘膦抗性的植株即两次草甘膦涂抹筛选后出现抗性性状的植株，移栽到大盆继续生长直至结实并进行PCR检测，获得阳性转化植株的种子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的培养基组成： 

YEP培养基：胰蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+氯化钠5g/L，pH 7.0；

农杆菌培养基：

YEP培养基+氯霉素50 mg/L+卡那霉素50mg/L+壮观霉素50 mg/L，pH 7.0；

菌体重悬液： 1/10MSB₅+AS100μmol/L+蔗糖3%，pH 5.4

共培培养基：1/10MSB₅+6-BA1.6mg/L+AS100μmol/L+蔗糖3%+琼脂0.5%  pH 5.4。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的含乙酰丁香酮的农杆菌侵染液的制备方法是：取单菌落于2mL添加100mg/L卡那霉素、100mg/L壮观霉素和25mg/L氯霉素的YEP液体培养基中，28℃摇床上200r/min振荡培养12-16h，待OD₆₀₀为0.6-0.8时，按1:1000的比例，再于28℃摇床上200r/min培养至对数期，取50mL离心管4000r/min，25℃离心10min收集菌体，用重悬液重悬菌体，加入100μmol/L的乙酰丁香酮。