[发明专利]一种生物合成乙基香兰素的方法

权利要求书

1.一种生物合成乙基香兰素的方法，其特征在于以3-乙氧基-4-羟基苯乙醇酸为底物，具体包括如下步骤：

(1)将含有扁桃酸脱氢酶基因的工程菌pET30a-mdlB的大肠杆菌BL21(DE3)接种于琼脂斜面培养基，活化，将活化后的菌种转接于含卡那霉素的LB种子培养基培养12h；

(2)以5％的接种量将种子培养液接种于含卡那霉素的LB发酵培养基，发酵，加入IPTG，使其终浓度为0.2mM，30℃诱导6h；

(3)离心收集发酵培养液中的菌体，除去上清液，用无菌水洗涤，悬浮于含O.5％的3-乙氧基-4-羟基苯乙醇酸的磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄ 1.12％，NaH₂PO₄ 2.14％，MgSO₄ 0.01％，pH＝7)，发酵，即得含3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸的溶液；将含有3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸的发酵液离心，取上清液，调pH＝7，灭菌，待用；

(4)将含有苯乙酮酸脱羧酶的恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)ATCC12633，经琼脂斜面培养基活化，转接于pH＝7的含KH₂PO₄2.0％、牛肉膏O.3％、蛋白胨1.0％、NaCl O.5％的种子培养基中，在30℃培养8h；

(5)将得到的种子培养液以50％的接种量接种于步骤(3)得到的含有3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸的发酵上清液，发酵，得含乙基香兰素的发酵液。

2.如权利要求1所述的生物合成乙基香兰素的方法，所述的步骤(1)中活化条件为在37℃培养24h。

3.如权利要求1所述的生物合成乙基香兰素的方法，所述的步骤(2)中发酵条件为在37℃培养2h。

4.如权利要求1所述的生物合成乙基香兰素的方法，所述的步骤(3)中离心条件为以5000rpm离心25min。

5.如权利要求1所述的生物合成乙基香兰素的方法，所述的步骤(3)中发酵条件为30℃，200rpm，发酵40h。

6.如权利要求1所述的生物合成乙基香兰素的方法，所述的步骤(5)中发酵条件为在30℃，200rpm，发酵24h。

7.如权利要求1所述的生物合成乙基香兰素的方法，所述的步骤(4)中的含有苯乙酮酸脱羧酶的恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)替换为含有苯乙酮酸脱羧酶基因的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法制得的乙基香兰素的用途，其特征在于，所述的乙基香兰素用于食品中呈甜巧克力香气。