[发明专利]一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法

权利要求书

1.一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）搭建N×N通道多频调制激光光路：将激光器（1）、扩束镜（2）、同轴H-PDLC透镜阵列（3）、滤波板（4）、透镜（5）同轴依次搭建，并与平台始终保持水平， 30mw准直半导体激光器（1） 发出的波长为405nm的光束耦合进扩束镜（2），扩束镜（2）出射的光束到达N×N式同轴H-PDLC透镜阵列（3）上进行分光和不同频率的斩波调制，使得通过N×N式同轴H-PDLC透镜阵列（3）上的液晶盒阵列的激光的焦点处在滤波板（4）上的小孔位置；

2）搭建N×N路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发光路：通过焦平面也在同轴H-PDLC透镜阵列（3）的焦平面F的透镜（5），将经H-PDLC透镜阵列（3）出射的聚焦的N×N束光调整为平行光束射出，耦合进入二向色镜组（6）中，经二向色镜组（6）激发的405nm的激光将耦合射入到放大倍率为40倍、数值孔径为0.65的无限远油浸显微物镜（7），将生物样品（8）摆放于三维调整架之上，调整三维调整架使生物样品（8）恰好处于显微物镜（7）焦平面上，光束将在物镜的作用下在生物样品（8）上聚焦为n²个光点，激发出荧光；

3）搭建n²路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像：由生物样品（8）表面激发的520nm-540nm绿色荧光在样品与显微物镜（7）相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜（7），成为平行光束，入射到二向色镜组（6）上，荧光全部从二向色镜组（6）透射出去，透射出的荧光入射分光棱镜（9）进行第二次分光，分成两部分，其中一部分由消色差透镜（10）会聚聚到 CCD摄像机（11）由CCD采集样品的信号最后在计算机中软件中得到样品细胞图像，另一部分荧光经一透镜（12）由光纤耦合器阵列（13）耦合并通过光纤（14）输送到光电倍增管PMT(15)中，该信号属于共焦扫描显微信号；

4）信号采集与处理部分的实现：光电倍增管PMT(15)将根据生物样品中激发得到的n²个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出，将光电倍增管的输出端接电压放大电路（16），电压放大电路（16）将PMT(15)采集到的微弱信号进行电压放大，接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机（17），计算机（17）通过Matlab软件，编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将经过调制的荧光信号相分离，按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品信息。

2.根据权利要求1所述同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，其特征在于，所述同轴H-PDLC透镜阵列（3）由N×N个液晶盒（18），液晶盒（18）的输入导线（19），各个液晶盒（18）之间的绝缘带（20）组成。

3.根据权利要求2所述同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，其特征在于，所述液晶盒（18）包括四部分：半球型玻璃盖（22）、固定极板（25）、绝缘环（23）、金属导线（24），首先将绝缘环（23）和半球型玻璃盖（22）组合起来，在他们之间插一根金属导线（24），确认金属导线（24）和半球型玻璃盖内表面的ITO膜（26）相交，引出的导线通过绝缘带引出来施加电压，再注入H-PDLC材料（21），再将固定极板（25）与上述整体装配起来，固定极板（25）上涂有ITO膜（27），面积和绝缘环（23）内环面积相等，为了加电压方便，将固定极板（25）上的ITO膜（27）延伸出来，绝缘带（20）上的导线（19）与单个液晶盒的两个电极相连，两个电极为金属导线（24）和固定极板（25）上涂有ITO膜（27）。

4.根据权利要求1所述同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，其特征在于，所述步骤4）中共焦显微镜的横向分辨率                                                和轴向分辨率分别表示为：、，其中，为所激发出的荧光的波长，表示显微物镜的数值孔径, 为所探测样品的有效折射率，样品中70%是水，可以设定值为1.3。

5.根据权利要求1所述同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，其特征在于，所述步骤4）中解调的具体过程为，先将调制信号与具有相同载波频率的余弦信号相乘，再通过低通滤波器滤去多余的频谱，即可得到原始信号。