[发明专利]一种添加二价金属化合物制备丁二酸的发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备丁二酸的发酵方法。

背景技术

丁二酸为大宗化学品，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，同时作为优秀的C4平台化合物，可用于合成1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。

利用微生物发酵法转化可再生资源(葡萄糖、木糖、木质纤维素水解液等)生产丁二酸，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可吸收固定CO₂，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，近年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要包括产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、重组大肠杆菌(Escherichia coli)和产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirilum succiniciproducens)。

丁二酸生产菌株在厌氧发酵过程中，除能积累丁二酸外，还有甲酸、乙酸、丙酮酸等杂酸，因此在整个发酵过程中需要添加酸中和剂控制pH值在一定的范围，其中效果较好的酸中和剂为碳酸镁、碳酸钠、氢氧化钙，且碳酸镁的效果优于碳酸钠。Jiang等人在利用E.coliAFP111两阶段发酵生产丁二酸过程中，当采用合成培养基并且碳酸镁作为酸中和剂时丁二酸的终浓度和产率分别达到101g/L和1.8g/Lh(Applied and Environmental Microbiology.2010，76(4)：1298-1300)。虽然采用碳酸镁作为酸中和剂获得了较高的生产水平，但其价格昂贵，是碳酸钠价格的2倍多，阻碍了丁二酸的工业化进程。因此采用碳酸钠作为酸中和剂将可大幅降低丁二酸的生产成本，但随着发酵的进行钠离子浓度将不断升高，在发酵后期高浓度的钠离子将可抑制丁二酸生产菌株的代谢性能，导致产物浓度及产率大幅下降。Lu等人在在利用E.coli AFP111两阶段发酵生产丁二酸过程中，当采用合成培养基并且氢氧化钙作为酸中和剂时丁二酸的终浓度和产率分别达到44g/L和1.9g/Lh(Journal of Biotechnology.2009，143：213-223)。

发明内容

本发明提供一种添加二价金属化合物制备丁二酸的发酵方法，降低生产成本，同时可以实现丁二酸的高浓度和高生产速率生产。

所述添加二价金属化合物制备丁二酸的发酵方法，在厌氧条件下发酵生产丁二酸，以碳酸钠作为酸中和剂采用反馈补料的方式控制pH值在6.4～6.8，同时在转厌氧初始开始以5～10mmol/Lh的速率恒速补加金属化合物，所添加的金属化合物以MgCl₂、Mg(OH)₂、CaCl₂、Ca(OH)₂或者FeCl₂中的一种或者两种以上的任意比例混合物的形式加入。

优选，所述的发酵培养基为合成培养基。

优选，经种子液制备得到液体培养基的菌体密度为0.6～0.8，在厌氧条件下发酵生产丁二酸的具体步骤为：按3～10％的接种量接种发酵培养基，以碳酸钠作为酸中和剂控制pH值在6.4～6.8，同时在转厌氧初始即恒速补加金属化合物并控制温度在35～40℃，同时以0.1～0.2vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维持发酵罐中厌氧环境。更优选控制发酵液中的金属化合物的补加速率为10mmol/Lh。

具体的发酵步骤可以是：

(1)菌种活化：从甘油冻存管中取少量菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h。

(2)种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下摇瓶培养6～8h，至菌体密度(OD₆₀₀)值在0.6～0.8之间。

(3)发酵产丁二酸过程：按3～10％的接种量接种发酵培养基，以碳酸钠作为酸中和剂以反馈补料的方式控制pH值在6.4～6.8，同时在转厌氧初始开始以5～10mmol/Lh的速率恒速补加金属化合物，控制温度在35～40℃，同时以0.1～0.2vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维持发酵罐中厌氧环境。