[发明专利]一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法。

背景技术

转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞，感受态细胞的状态是影响转化效率最直接、关键的因素之一。通常有两种方法获得感受态细胞，一种是购于商业公司，这种感受态通常有较高的转化效率，每微克质粒DNA产生10⁸个转化克隆的转化效率，但价格比较昂贵。另一种方法是实验室自己制备，目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl₂和Inoue法。CaCl₂法简便易行，但制备的感受态细胞转化效率较低；Inoue法虽然感受态细胞的转化效率较高，但细菌的培养条件是18℃，振荡19-50小时，摇菌的时间较长，并且过程相对繁琐。因而，研究一种转化效率高、操作简单实用的感受态细胞制备方法，对于分子生物学的研究尤为必要。

发明内容

本发明的目的是：提供一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，它是一种转化效率高、方便快捷、重复性好的感受态细胞制备方法。

本发明的大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，为将常规液体培养至对数生长期的大肠杆菌，在大肠杆菌的最适生长温度下(一般为37℃)振荡扩大培养至OD600为0.4-0.5左右，然后转入17-19℃，振荡培养0.9-1.1小时，再离心收集菌体后，采用氯化钙法制备感受态细胞。具体的，本发明的大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法包括下列步骤：

1)从LB平板上挑选新活化的大肠杆菌单菌落接种于LB液体培养基中，37℃，振荡培养过夜；

2)将步骤1获得的菌悬液接种于新鲜的LB液体培养基中，在大肠杆菌的最适生长温度下(一般为37℃)振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.5左右；

3)将步骤2获得的菌悬液转入17-19℃，振荡培养0.9-1.1小时；

4)将步骤3获得的菌悬液加入无菌离心管中，冰浴后，冷冻离心收集菌体，弃上清，保留细胞沉淀；

5)用无菌的0.09-0.11MCaCl₂水溶液重悬步骤4离心分离的菌体后冰浴；

6)将步骤5获得的重悬液冷冻离心再次收集菌体，弃上清，保留细胞沉淀；

7)再用无菌的0.09-0.11MCaCl₂水溶液重悬步骤6离心分离的菌体，即得感受态细胞。

步骤1中，长有新活化的大肠杆菌单菌落的LB平板可采用常规方法获得，如将大肠杆菌贮存菌液在无抗生素的LB平板上划线，37℃过夜培养获得。

步骤1-3中，大肠杆菌振荡培养的转速可采用常规，如200-250rpm。

步骤4-5中，冰浴的时间一般为8-12分钟。

步骤4-5中，冷冻离心收集菌体的条件可采用常规，如温度为3-5℃，离心力2950-3050g，离心时间4-6分钟。

步骤5和7所用的CaCl₂水溶液的浓度及添加量，均可与常规氯化钙法一致。

较佳的，步骤5中，CaCl₂水溶液与步骤4所取菌悬液的体积比为1∶(9-11)。步骤7中，CaCl₂水溶液与步骤4所取菌悬液的体积比为1∶(48-52)。

较佳的，步骤4所述的无菌离心管、步骤5和7所述的CaCl₂水溶液均经预冷。

进一步的，在步骤7之后，可加入无菌甘油，使甘油最终含量达到15-20％(体积百分比)，分装冻存感受态细胞。

本发明的有益效果是：该方法转化率高，操作简单，重复性好，能满足常规的分子生物学实验要求，是一项较为实用的新技术，具有极高的应用价值。

具体实施方式：

以下列举实施例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制专利的保护范围。

实施例1：大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化效率测定

本实施例中所用的材料和试剂如下：

材料：受体菌DH5α由本实验室保存；pUC19来自生工生物工程(上海)有限公司。

试剂：

LB液体培养基：蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，蒸馏水定容至1升，PH7.0，121℃灭菌20分钟。