[发明专利]生产L-异亮氨酸的工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产L-异亮氨酸的工程菌及其应用。

背景技术

L-异亮氨酸(L-Ile)是人体八种必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。L-异亮氨酸对维持成人、婴儿、儿童的生长发育有重要作用，缺乏可导致骨骼肌萎缩和变形。

L-异亮氨酸广泛应用于医药和食品领域，如果人体缺乏L-异亮氨酸，将导致食欲不振、体质下降、贫血及其它功能障碍。在医学领域，L-异亮氨酸主要用于一般营养型复合氨基酸输液、要素膳，大量用于配制治疗型特种氨基酸输液(如肝安、肾安氨基酸输液，特别是以L-异亮氨酸为主要原料生产的高支链氨基酸输液、肝安糖浆、肝灵口服液)，对治疗各种肝脏疾病具有显著疗效，其用量逐年增长。近年来L-异亮氨酸在运动食品行业也得到广泛关注，将L-异亮氨酸作为运动食品的添加剂，有助于增进肌肉的生长发育。

L-异亮氨酸的主要生产方法有提取法、化学合成法、发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-异亮氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-异亮氨酸最主要的方法。直接发酵法借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过菌株的选育，以解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏，达到过量积累L-异亮氨酸的目的，也是微生物发酵法当中工业应用最为广泛的。国际上，L-异亮氨酸目前合计年产量约达900吨。鉴于生产的高难度，L-异亮氨酸一直是高价氨基酸。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产L-异亮氨酸的工程菌及其应用。

本发明保护将重组质粒导入黄色短杆菌得到的重组菌；所述重组质粒为将ilvBN蛋白(乙酰羟酸合成酶)的编码基因和ilvA^R蛋白(抗终产物异亮氨酸反馈抑制的苏氨酸脱水酶)的编码基因的表达盒插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述黄色短杆菌的CICC编号为23655；所述ilvBN蛋白由多肽甲和多肽乙组成；所述多肽甲如序列表的序列1自N末端第1至562位氨基酸残基所示；所述多肽乙如序列表的序列1自N末端第563至659位氨基酸残基所示；所述ilvA^R蛋白如序列表的序列3所示。

所述ilvBN蛋白的编码基因可如序列表的序列2自5’末端第1至1983位核苷酸所示；所述ilvA^R蛋白的编码基因可如序列表的序列4自5’末端第191至1501位核苷酸所示。

所述ilvA^R蛋白的编码基因的表达盒自上游至下游可依次包括T7启动子、所述ilvA^R蛋白的编码基因和T7终止子。所述T7启动子可如序列表的序列4自5’末端第1至118位核苷酸所示。所述T7终止子可如序列表的序列4自5’末端第1581至1654位核苷酸所示。所述ilvA^R蛋白的编码基因的表达盒具体可如序列表的序列4所示。

所述重组质粒中，自上游至下游可依次包括所述ilvBN蛋白的编码基因和所述ilvA^R蛋白的编码基因的表达盒。

所述出发载体具体可为载体pXMJ19。

所述重组质粒具体可为将所述ilvBN蛋白的编码基因插入所述载体pXMJ19的Pst I和BamHI酶切位点之间，所述ilvA^R蛋白的编码基因的表达盒插入所述载体pXMJ19的EcoRI酶切位点得到的重组质粒。

所述重组菌为具体可为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MFBF-04。黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MFBF-04简称黄色短杆菌MFBF-04，已于2012年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2012050。

以上任一所述重组菌均可用于生产L-异亮氨酸。

本发明还保护一种生产L-异亮氨酸的方法，包括如下步骤：将以上任一所述的重组菌进行发酵，得到L-异亮氨酸。